Name: purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes
Uploaded: 2012-06-19T13:00:00
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La investigación en nuestro laboratorio fue apoyada por el Instituto Max von Pettenkofer, Ludwig-Maximilians de Munich, la Universidad, la Fundación Alemana de Investigación (DFG, HI 1511/3-1) y el Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) &quot;Genómica Médica de infección&quot; iniciativa ( 0315834C).

1. Los preparativos para el Aislamiento de LCV <ol><li> Streak a Legionella pneumophila produce DsRed-Express 13,14 de las existencias de glicerol en placas de agar CYE con 5 mg / ml de cloranfenicol (Cam) cuatro días antes del aislamiento LCV. Incubar las bacterias a 37 ° C. </li><li> Semillas de 1 x 10 7 D. discoideum la producción de GFP-calnexina o RAW264.7 macrófagos murinos en cultivo 75 cm 2 frascos de un tejido de la infección antes de los días. Utilizar...

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	<li>Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+spp.+outdoors:+colonization,+communication+and+persistence.">Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).</li><li>Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot/Icm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila.">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS ONE. 6, e17638 (2011).</li><li>Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchors+for+effectors:+subversion+of+phospho-inositide+lipids+by+Legionella.">Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella.</a> Front Microbiol. 2, 91 (2011).</li><li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors.">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li><li>Kima, P. E., Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+calnexin+expression+on+phagosomes+to+isolate+Leishmania+parasitophorous+vacuoles.">Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles.</a> Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).</li><li>L&#252;hrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages.">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).</li><li>Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+Mycobacterium+and+the+macrophage+analyzed+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).</li><li>Fernandez-Mora, E., Polidori, M., L&#252;hrmann, A., Schaible, U. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages:+Y.+pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded.">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).</li><li>Shevchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+Legionella-containing+phagosomes+isolated+from+Dictyostelium.">Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium.</a> Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).</li><li>Brombacher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab1+guanine+nucleotide+exchange+factor+SidM+is+a+major+phosphatidylinositol+4-phosphate-binding+effector+protein+of+Legionella+pneumophila.">Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila.</a> J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).</li><li>Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Legionella-containing+vacuoles+by+immuno-magnetic+separation.">Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).</li><li>Urwyler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Legionella+vacuoles+purified+by+magnetic+immunoseparation+reveals+secretory+and+endosomal+GTPases.">Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases.</a> Traffic. 10, 76-87 (2009).</li><li>Mampel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planktonic+replication+is+essential+for+biofilm+formation+by+Legionella+pneumophila+in+a+complex+medium+under+static+and+dynamic+flow+conditions.">Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).</li></ol>

En contraste con los métodos publicados anteriormente, este protocolo se basa en dos pasos, primero la separación de LCV por un enfoque inmuno-magnética, y en segundo lugar, la purificación de LCV por centrifugación en gradiente de densidad. El aislamiento LCV se pueden seguir fácilmente por microscopía de fluorescencia, cuando sea bacterias marcadas fluorescentemente y las células productoras de GFP o tinción de anticuerpos se utiliza. El protocolo se describe aquí es un sencillo, recto hacia adelante método...

purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes

El patógeno oportunista Legionella pneumophila es una bacteria resistente a la ameba, que también se replica en los macrófagos alveolares por lo tanto causantes de la neumonía grave &quot;Enfermedad de los Legionarios&quot; 1. En los fagocitos protozoos y mamíferos, L. pneumophila emplea un mecanismo conservado para formar un procedimiento específico, la replicación permisiva del compartimiento, la &quot;Legionella contiene vacuola&quot; (LCV). La formación de vehículos comerciales requiere la bacteria icm / Dot sistema de secreción tipo IV (T4SS), que se transloca hasta 275 &quot;efector&quot; proteínas en las células huésped. Los efectores manipulan proteínas del huésped, así como los lípidos y comunicarse con secreción, organelos endosomal mitocondrial y 2-4. La formación de los LCV representa un proceso complejo, robusto y redundante, lo que es difícil de entender de una manera reduccionista. Un enfoque integral es necesaria para comprender globalmente la formación de vehículos comerciales ligeros, incluyendo un análisis global de la trayectoriaacogida ogen las interacciones de los factores y su dinámica temporal y espacial. Como un primer paso hacia esta meta, vehículos comerciales intactas son purificados y analizados por la proteómica y la lipidómica. La composición y la formación de agentes patógenos que contienen vacuolas ha sido investigado por el análisis proteómico mediante cromatografía líquida o 2-D electroforesis en gel acoplado a espectrometría de masas. Vacuolas aisladas, ya sea del suelo de la sociedad ameba Dictyostelium discoideum, o los fagocitos de mamíferos albergaba Leishmania 5, Listeria 6, 7 Mycobacterium, Rhodococcus 8, 9 o Salmonella spp Legionella. 10. Sin embargo, los protocolos de purificación empleadas en estos estudios son mucho tiempo y tedioso, ya que requieren microscopía electrónica por ejemplo, para analizar la morfología LCV, la integridad y la pureza. Además, estos protocolos no explotar las características específicas de la vacuola es patógeno pararichment. El método que aquí se presenta supera estas limitaciones mediante el empleo de D. discoideum produciendo un marcador fluorescente de vehículos comerciales ligeros y por la orientación de la SIDC bacteriana proteína efectora, que selectivamente ancla a la membrana de vehículos comerciales ligeros de la unión a fosfatidilinositol 4-fosfato (PtdIns (4) P) 3,11. LCV están enriquecidos en un primer paso por inmuno-separación magnética usando un anticuerpo purificado por afinidad primaria contra SIDC y un anticuerpo secundario acoplado a perlas magnéticas, seguido en un segundo paso por una centrifugación en gradiente de densidad clásica Histodenz 12,13 (fig. 1) . Un estudio del proteoma de vehículos comerciales aislados de D. discoideum reveló más de 560 proteínas de la célula huésped, incluidas las proteínas asociadas a vesículas fagocíticas, ER mitocondrias y aparato de Golgi, así como las GTPasas varios que no han sido implicados en la formación antes del 13 de LCV. LCV enriquecido y purificado con elprotocolo descrito aquí pueden ser analizadas por microscopía (inmunofluorescencia, microscopía electrónica), los métodos bioquímicos (Western blot) y los enfoques proteómicos o lipidomic.

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Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Este artículo describe un método para el aislamiento y purificación de intacta<em&gt; Legionella</em&gt; Que contienen vacuolas (LCV) de amebas y los macrófagos. El protocolo de dos pasos comprende enriquecimiento LCV por inmuno-separación magnética usando un anticuerpo contra un marcador bacteriano LCV y purificación adicional por centrifugación en gradiente de densidad.

La purificación del patógeno a partir de vacuolas<em&gt; Legionella</em&gt; Infectados por fagocitos

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

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Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

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Un día de flujo de trabajo Método de detección de patógenos bacterianos y pruebas de resistencia a los antimicrobianos de cultivos de sangre

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

La purificación y la visualización de lipopolisacárido de bacterias Gram-negativas por Hot acuosa de fenol-Extracción

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Purificación por afinidad de los complejos de ribonucleoproteína Influenza Virus de la cromatina de las células infectadas

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Vídeo en vivo de células Microscopía de fagocitosis hongo patógeno

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

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Isotérmico de amplificación (LAMP) Ensayos Loop mediada para la detección específica de las especies de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectan pollos

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

La purificación del ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En los macrófagos

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

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El desarrollo y la identificación de una subpoblación de Novela derivada de neutrófilos humanos fagocitos gigante<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Desenredar la función de un efector bacteriana de una planta de patógenos no cultivables Uso de una levadura de dos híbridos pantalla

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

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Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad

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