Name: quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts
Uploaded: 2012-08-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts at JoVE.com

Эта работа была поддержана благотворительные фонды из Университета Западной Вирджинии Мария Babb Randolph онкологический центр. Мы благодарим Susette Мюллер (Georgetown University) и Лора Келли для ранней консультации и помощь. Использование West Virginia University фонда изображений микроскопии (при поддержке Марии Babb Randolph онкологический центр и, NIH гранты RR16440 P20, P30 и P30 RR032138 GM103488) с благодарностью.

1. Производство Орегон Зеленый 488-желатин покрытием Покровные <ol><li> Подготовка немеченого 5% (м / м) акции желатина / раствор сахарозы путем добавления 1,25 г желатина и 1,25 г сахарозы в PBS до конечного объема 50 мл. Теплый склад желатиновый раствор до 37 ° С и убедитесь, что он полностью растаял ?...

<ol>
	<li>Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+at+the+leading+edge.">Life at the leading edge.</a> Cell. 145, 1012-1022 (2011).</li><li>Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'ins'+and+'outs'+of+podosomes+and+invadopodia:+characteristics,+formation+and+function.">The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).</li><li>Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degrading+Devices:+Invadosomes+in+Proteolytic+Cell+Invasion.">Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. , (2010).</li><li>Chen, W. T., Chen, J. M., Parsons, S. J., Parsons, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+degradation+of+fibronectin+at+sites+of+expression+of+the+transforming+gene+product+pp60src.">Local degradation of fibronectin at sites of expression of the transforming gene product pp60src.</a> Nature. 316, 156-158 (1985).</li><li>Artym, V. V., Zhang, Y., Seillier-Moiseiwitsch, F., Yamada, K. M., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+interactions+of+cortactin+and+membrane+type+1+matrix+metalloproteinase+at+invadopodia:+defining+the+stages+of+invadopodia+formation+and+function.">Dynamic interactions of cortactin and membrane type 1 matrix metalloproteinase at invadopodia: defining the stages of invadopodia formation and function.</a> Cancer Res. 66, 3034-3043 (2006).</li><li>Ayala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+regulatory+inputs+converge+on+cortactin+to+control+invadopodia+biogenesis+and+extracellular+matrix+degradation.">Multiple regulatory inputs converge on cortactin to control invadopodia biogenesis and extracellular matrix degradation.</a> J. Cell Sci. , (2008).</li><li>Ammer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saracatinib+impairs+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+invasion+by+disrupting+invadopodia+function.">Saracatinib impairs head and neck squamous cell carcinoma invasion by disrupting invadopodia function.</a> J. Cancer Sci. Ther. 1, 52-61 (2009).</li><li>Seals, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptor+protein+Tks5/Fish+is+required+for+podosome+formation+and+function,+and+for+the+protease-driven+invasion+of+cancer+cells.">The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells.</a> Cancer Cell. 7, 155-165 (2005).</li><li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+invadopodium+formation:+the+role+of+the+N-WASP-Arp2/3+complex+pathway+and+cofilin.">Molecular mechanisms of invadopodium formation: the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin.</a> J. Cell Biol. 168, 441-452 (2005).</li><li>Kopp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin+KIF1C+and+microtubule+plus+ends+regulate+podosome+dynamics+in+macrophages.">The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2811-2823 (2006).</li><li>Oser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+regulates+cofilin+and+N-WASp+activities+to+control+the+stages+of+invadopodium+assembly+and+maturation.">Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation.</a> J. Cell. Biol. 186, 571-587 (2009).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).</li><li>Kelley, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Src+requires+a+wild-type+counterpart+to+regulate+invadopodia+maturation.">Oncogenic Src requires a wild-type counterpart to regulate invadopodia maturation.</a> J. Cell Sci. 123, 3923-3932 (2010).</li><li>Chen, W. T., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+is+not+present+in+the+focal+adhesions+formed+between+normal+cultured+fibroblasts+and+their+substrata.">Fibronectin is not present in the focal adhesions formed between normal cultured fibroblasts and their substrata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 7318-7322 (1980).</li><li>Chen, W. T., Olden, K., Bernard, B. A., Chu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transformation-associated+protease(s)+that+degrade+fibronectin+at+cell+contact+sites.">Expression of transformation-associated protease(s) that degrade fibronectin at cell contact sites.</a> J. Cell Biol. 98, 1546-1555 (1984).</li><li>Bharti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src-dependent+phosphorylation+of+ASAP1+regulates+podosomes.">Src-dependent phosphorylation of ASAP1 regulates podosomes.</a> Mol. Cell Biol. 27, 8271-8283 (2007).</li><li>Albrechtsen, R., Stautz, D., Sanjay, A., Kveiborg, M., Wewer, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+engagement+of+ADAM12+induces+clusters+of+invadopodia+with+localized+ectodomain+shedding+activity.">Extracellular engagement of ADAM12 induces clusters of invadopodia with localized ectodomain shedding activity.</a> Exp. Cell Res. 317 (10), 195-209 (2011).</li><li>Scott, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=kinases+are+required+for+invasive+path+generation+by+tumor+and+tumor-associated+stromal+cells.">kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells.</a> J. Cell Biol. 191, 169-185 (2010).</li><li>Mueller, S. C., Yeh, Y., Chen, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+membrane+proteins+mediates+cellular+invasion+by+transformed+cells.">Tyrosine phosphorylation of membrane proteins mediates cellular invasion by transformed cells.</a> J. Cell. Biol. 119, 1309-1325 (1992).</li><li>Bowden, E. T., Coopman, P. J., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia:+unique+methods+for+measurement+of+extracellular+matrix+degradation+in+vitro.">Invadopodia: unique methods for measurement of extracellular matrix degradation in vitro.</a> Methods Cell Biol. 63, 613-627 (2001).</li><li>Baldassarre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+participates+in+focal+extracellular+matrix+degradation+by+invasive+cells.">Dynamin participates in focal extracellular matrix degradation by invasive cells.</a> Mol. Biol. Cell. 14, 1074-1084 (2003).</li><li>Alexander, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+promotes+invadopodia+activity.">Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity.</a> Curr. Biol. 18, 1295-1299 (2008).</li><li>Artym, V. V., Yamada, K. M., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+degradation+assays+for+analyzing+local+cell+invasion.">ECM degradation assays for analyzing local cell invasion.</a> Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).</li><li>Schoumacher, M., Goldman, R. D., Louvard, D., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin,+microtubules,+and+vimentin+intermediate+filaments+cooperate+for+elongation+of+invadopodia.">Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia.</a> J. Cell Biol. 189, 541-556 (2010).</li><li>Clark, E. S., Whigham, A. S., Yarbrough, W. G., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+is+an+essential+regulator+of+matrix+metalloproteinase+secretion+and+extracellular+matrix+degradation+in+invadopodia.">Cortactin is an essential regulator of matrix metalloproteinase secretion and extracellular matrix degradation in invadopodia.</a> Cancer Res. 67, 4227-4235 (2007).</li><li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+3-kinase+signaling+pathway+mediated+by+p110alpha+regulates+invadopodia+formation.">Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110alpha regulates invadopodia formation.</a> J. Cell Biol. 193, 1275-1288 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin-bundling+protein+fascin+stabilizes+actin+in+invadopodia+and+potentiates+protrusive+invasion.">The actin-bundling protein fascin stabilizes actin in invadopodia and potentiates protrusive invasion.</a> Curr. Biol. 20, 339-345 (2010).</li><li>Yamaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-bisphosphate+and+PIP5-kinase+Ialpha+are+required+for+invadopodia+formation+in+human+breast+cancer+cells.">Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and PIP5-kinase Ialpha are required for invadopodia formation in human breast cancer cells.</a> Cancer Sci. , (2010).</li></ol>

Способность визуализировать клетки унижающие внеклеточного матрикса помог в раскрытии молекулярных механизмов, занятых в ранних стадиях клеточного вторжения. Pioneered Вэнь-тянь Chen в начале 1980-х годов 4,14,15, покрытием флуоресцентно меченых белков внеклеточного на стекло покровные д...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название Реагенты / Инструмент </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> желатин </td><td> Сигма </td><td> G1890 </td><td> Свиной кожи </td></tr><tr><td> сахарозы </td><td> Рыбак </td><td> BP220 </td><td></td></tr><tr><td> 12 мм покровные </td><td> Рыбак </td><td> 50-121-5159 </td><td></td></tr><tr><td> 24-луночные планшеты </td><td> Рыбак </td><td> 08-772-1 </td><td> BD Falcon </td></tr><tr><td> азотнокислый </td><td> Рикка </td><td> R5326000 </td><td> 20% раствор </td></tr><tr><td> поли-L-лизин </td><td> Электрон наук микроскопии </td><td> 19320-B </td><td> 0,1% раствор </td></tr><tr><td> глутаральдегида </td><td> Сигма </td><td> G7526 </td><td> 8% раствор </td></tr><tr><td&gt; Орегон Зеленый 488-сопряженных желатина </td><td> Invitrogen </td><td> G-13186 </td><td></td></tr><tr><td> натрийборгидрида </td><td> Сигма </td><td> 213462 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Рыбак </td><td> BP151 </td><td></td></tr><tr><td> родамина-фаллоидином </td><td> Invitrogen </td><td> R415 </td><td></td></tr><tr><td> анти-cortactin (клон 4F11) </td><td> Millipore </td><td> 05-180 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Flag антитела </td><td> Millipore </td><td> MAB3118 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 козьего анти-IgG мыши </td><td> Invitrogen </td><td> A21235 </td><td></td></tr><tr><td> Продлить Золотой antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 конфокальный микроскоп </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ программного обеспечения </td><td> Всеобщее достояние </td><td></td><td> <a href="http://www.macbiophotonics.ca/imagej/" target="_blank">http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</a> </td></tr><tr><td> AutoQuant X2.2 программного обеспечения </td><td> Медиа кибернетики </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS Elements программного обеспечения </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts

Сотовый вторжения в местных тканей является важным процессом в развитии и гомеостаза. Malregulated вторжения и последующего движения клетки характерно несколько патологических процессов, в том числе воспаление, сердечно-сосудистые заболевания и метастазов опухолевых клеток 1. Сосредоточен деградации протеолитическими внеклеточного матрикса (ECM) компонентов в эпителиальной или эндотелиальной базальной мембраны является важным шагом в налаживании сотовой вторжения. В опухолевых клетках, обширный анализ в лабораторных установила, что ECM деградации осуществляется вентральной актина богатых мембранных структур называют выступающими invadopodia 2,3. Invadopodia форме в тесном прикладывание к ECM, где они отвечают ECM пробоя под действием матриксных металлопротеиназ (ММП). Способность опухолевых клеток с образованием invadopodia прямо коррелирует со способностью вторгаться в местные стромы и связанные с ними сосудистые компоненты 3. _content &quot;&gt; Визуализация invadopodia ECM-опосредованной деградации клеток с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием красителей-меченых белков матрицы наносится на стекло покровные стала наиболее распространенной техникой для оценки степени протеолиза матрицы и сотовые инвазивный потенциал 4,5. Здесь мы опишем версия стандартный метод генерации флуоресцентно-меченных покровные стекла с использованием коммерчески доступных Орегон Зеленый-488 желатином сопряжены. этот метод легко масштабируется быстро производить большое количество покрытием покровные. Покажем некоторые общие микроскопические артефакты, которые часто встречаются Во время этой процедуры и как их можно избежать. Наконец, мы опишем стандартные методы использования доступны компьютерные программы, чтобы количественное меченых желатин деградации матрицы опосредовано отдельных клеток и целых клеточных популяций. описанные процедуры дают возможность точно и воспроизводимо мониторинг invadopodiaдеятельности, а также может служить в качестве платформы для оценки эффективности модуляции экспрессии белка или тестирование по борьбе с инвазивными соединений на деградацию внеклеточных матриц в одно-и многоклеточных настройки.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts at JoVE.com

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Мы описываем прототип способ получения микроскопом покровные покрыта флуоресцентной желатина для визуализации invadopodia-опосредованной деградации матрице. Вычислительные методы с использованием доступного программного обеспечения представлены для количественного определения результирующего уровня матрицы протеолиза одной клетки в смешанной популяции и для многоклеточных группы охватывает весь микроскопических полей.

Количественное измерение Invadopodia-опосредованного протеолиза внеклеточной матрицы в одно-и многоклеточных контексты

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Изучение Протеолиз циклин B на одном уровне клеток в популяции клеток Всего

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Зонд на основе ПЦР в реальном времени подходов к количественному измерению микроРНК

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Измерение внеклеточного ионных потоков, используя ион-селективный автореферентных Микроэлектродные Техника

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Обогащение белков внеклеточного матрикса из тканей и пищеварения в пептидов для анализа масс-спектрометрии

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Эффективное млекопитающих выражение клеток и Пошаговый Очистка внеклеточной гликопротеинов для кристаллизации

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Измерение и анализ внеклеточной кислоты производства, чтобы определить гликолитических Оценить

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Сканирующая электронная микроскопия из размоченной ткани для визуализации внеклеточный матрикс

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

Быстрой, масштабируемый способ выделения, функционального исследования и анализа клеточного происхождения внеклеточной матрицы

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Использование микрофлюидальных устройств для измерения срок службы и сотовых фенотипов в одиночных дрожжевых клетках почкования

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...