Name: antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door het Bureau van Onderzoek en Ontwikkeling, Medische Research Service, Department of Veterans Affairs. Deze studie werd gefinancierd door een VA Merit Beoordeling Award (voor MCL) en de Universiteit van Tennessee Health Science Center Multiple Sclerose Onderzoek Fonds.

1. Labeling antilichaam (figuur 1) <ol><li> Maak 0,1 M NaHCO3 buffer: <ul type="circle"><li> 8,4 g NaHCO3 </li><li> 29,2 g NaCl </li><li> 1 liter H 2 O </li></ul></li><li> Breng de buffer tot een pH van 8,4 met deze oplossing (10,6 g Na 2 CO 3, 29,2 g NaCl, 1 liter H 2 0). </li><li> Voeg 35 ul Atto550 NHS tot 70 pi anti-hnRNPA1 en 500 ul buffer NaHCO3 en draaien gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na de een uur durende rotatie, injecteren h...

<ol>
	<li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse.">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li><li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambert-Eaton+syndrome+antibodies:+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft.">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li><li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTLV-1+induced+molecular+mimicry+in+neurological+disease.">HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).</li><li>Reeves, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.+Antibodies+to+DNA,+DNA-binding+proteins,+and+histones.">Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones.</a> Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).</li><li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+due+to+molecular+mimicry+as+a+cause+of+neurological+disease.">Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease.</a> Nat. Med. 8, 509-513 (2002).</li><li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+that+recognize+functional+domains+of+hnRNPA1+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+neurological+disease.">Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease.</a> Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).</li><li>Kalume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mimicry:+cross-reactive+antibodies+from+patients+with+immune-mediated+neurologic+disease+inhibit+neuronal+firing.">Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing.</a> J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).</li><li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reactivity+between+immunodominant+human+T+lymphotropic+virus+type+I+tax+and+neurons:+implications+for+molecular+mimicry.">Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry.</a> J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).</li><li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+link+between+autoimmunity+and+neurodegeneration+in+immune-mediated+neurological+disease.">A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).</li><li>Smeenk, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies:+cause+of+disease+or+caused+by+disease.">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li><li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease.">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li><li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection.">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li><li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells.">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li><li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer,+Axl,+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases.">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+'passive+transfer'+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen.">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiff,+twitchy+or+wobbly:+are+GAD+antibodies+pathogenic.">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li><li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy.">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li><li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition.">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li></ol>

Om hypothesen specifieke moleculen en hun expressie testen worden genen en andere vectoren gewoonlijk getransfecteerd in cellen. Het unieke aspect van deze procedure is de mogelijkheid om eenvoudig antilichamen transfecteren in doelcellen. We hebben deze methode in vijf verschillende experimenten elk in duplo. Transfectie efficiëntie resultaten waren vergelijkbaar voor alle experimenten. Belangrijk is dat de methode kan toegang van antilichamen in de cel zonder dat antilichaam structuur of functie. Verder met het gebru...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> Fluorescerende Microscoop AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> AxioVision versie 4.2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> FITC anti-Rigg gelabeld </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 NHS ester </td><td> Sigma </td><td> 92835 </td></tr><tr><td> Ab-DeliverIN </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> +10% FBS DMEM/F12 +1% antibiotica </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> Poly-D-lysine 8-en Cultuur Slides </td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td> Multi-Purpose Rotator </td><td> Wetenschappelijke Industries Inc </td><td> Model 151 </td></tr><tr><td> DAPI Montage Media </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Kunstnier </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 66380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (4% oplossing) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis

Antilichamen de mogelijkheid om nieuwe inzicht te krijgen in de verschillende evenementen die plaatsvinden in levende systemen. De mogelijkheid om zeer specifieke antistoffen doeleiwitten is toegestaan ​​voor zeer precieze biologische vragen worden aangepakt. Belangrijker is dat antilichamen betrokken bij de pathogenese van een aantal menselijke ziekten zoals systemische lupus erythematosus (SLE), reumatoïde artritis (RA), paraneoplastische syndromen, multiple sclerose (MS) en menselijk T-lymfotroop virus type 1 (HTLV-1) bijbehorende myelopathie / tropische spastische paraparese (HAM / TSP) 1-9. Hoe antilichamen veroorzaken ziekte is een gebied van verder onderzoek, en gegevens suggereren dat de interacties tussen antilichamen en verschillende intracellulaire moleculen resulteert in ontsteking, cellulaire messaging en apoptose 10 veranderd. Het is aangetoond dat patiënten met MS en HAM / TSP auto-antilichamen te produceren voor de intracellulaire RNA bindend eiwit heterogene ribonuclear proteïne A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Recente gegevens wijzen erop dat antilichamen tegen zowel intra-neuronale en oppervlakteantigenen pathogene 3, 5-9, 11. Zo een procedure waarbij voor de studie van intracellulaire antilichamen: eiwit interacties zijn goed inzicht geven in ziekte pathogenese. Genen worden gewoonlijk getransfecteerd in primaire cellen en cellijnen in cultuur is echter transfectie van antilichamen in cellen gehinderd door verandering van antilichaamstructuur of slechte transfectie-efficiëntie 12. Andere werkwijzen voor transfectie omvatten antilichaam transfectie gebaseerd op kationische liposomen (bestaande uit DOTAP / DOPE) en polyethyleeniminen (PEI), die resulteerden in een tienvoudige afname in antilichaam transfectie in vergelijking met controles 12. De werkwijze uitgevoerd in ons onderzoek is vergelijkbaar met kationische lipidegemedieerde werkwijzen en gebruiken van een lipide-gebaseerd mechanisme niet-covalente complexen met de antilichamen door elektrostatische en hydrophobic interacties 13. We gebruik Ab-DeliverIN reagens, een lipide formulering kan vastleggen antilichamen door niet-covalente elektrostatische en hydrofobe interacties en hen in cellen. Zo chemische en genetische koppelingen zijn niet noodzakelijk voor de levering van functionele antilichamen in levende cellen. Deze methode heeft ons u verschillende antilichaam opsporing en eiwit lokalisatie experimenten, alsmede de analyse van de moleculaire gevolgen van intracellulaire antilichamen: eiwitinteracties 9. In dit protocol zullen we zien hoe antilichamen transfecteren tot neuronen snel, reproduceerbaar en met een hoge transfectie-efficiëntie. Als voorbeeld zullen we anti-hnRNP A1 en anti-IgG antilichamen. Voor eenvoudige kwantificering van transfectie efficiency we anti-hnRNP A1 antilichamen gemerkt met Atto-550-NHS en FITC-gelabelde IgG. Atto550 NHS is een nieuw label met een hoog moleculair absorptie en quantum yield. Excitatiebron en fluorescerende filters voor Atto550 zijn vergelijkbaar met Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Bovendien Atto550 een hoge fotostabiliteit. FITC-gelabelde IgG werden gebruikt als controle om aan te tonen dat deze methode is veelzijdig en niet afhankelijk verven. Deze aanpak en de gegevens die gegenereerd zal helpen bij het begrijpen van de rol die antilichamen tegen intracellulaire doelantigenen zouden kunnen spelen in de pathogenese van ziekten.

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis at JoVE.com

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Een snelle benadering van interacties en effecten op moleculaire mechanismen van de aanwezigheid van antilichamen in een intracellulaire omgeving onderzoeken beschreven. De werkwijze omvat transfectie van antilichamen in levende cellen met een niet-covalente complexvorming gebaseerd op een lipide formulering. De techniek is toepasbaar voor geïmmortaliseerde cellijnen en primaire cellen.

Antilichaam Transfectie in Neuronen als een instrument om de ziekte Pathogenese Studie

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser capture microdissectie van Drosophila Perifere neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-loading: Een handig hulpmiddel is voor de behandeling van de omvang van Gap Junction Tracer koppeling tussen het netvlies Neuronen

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumfosfaattransfectie van Primary hippocampus neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Real-Time Impedantie-gebaseerde Cell Analyzer als een instrument af te bakenen moleculaire pathways betrokken bij neurotoxiciteit en Neuroprotectie in een neuronale cellijn,

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Het olfactorisch systeem als model om axonale groeipatronen en morfologie Bestudeer<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Intramusculaire injecties Langs de Motor End Plates: een minimaal invasieve benadering van Shuttle Tracers Rechtstreeks in Motor Neuronen

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Assay aan de Aantrekkelijke of Repulsive activiteit van een eiwit ondergrond met Gescheiden hippocampus Neuronen Studie

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic Hippocampal Slice culturen als een Model voor de studie neuroprotectie en invasiviteit van tumorcellen

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Exogene toediening van Alpha-synuclein Microsomes-geassocieerde aggregaten te primaire neuronen als een krachtige cel Model van de vorming van fibrillen

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Cel-gebaseerde Assay te bestuderen van antilichaam-gemedieerde Tau goedkeuring door Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...