Name: antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00
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Ce travail est soutenu par le Bureau de la recherche et du développement, de la recherche médicale Service, Department of Veterans Affairs. Cette étude a été financée par une bourse de l&#39;examen du mérite VA (à MCL) et à l&#39;Université du Tennessee Health Science Center de la sclérose multiple Fonds de recherche.

1. Marquage de l&#39;anticorps (figure 1) <ol><li> Assurez 0,1 M de tampon NaHCO 3: <ul type="circle"><li> 8,4 g de NaHCO 3 </li><li> 29,2 g de NaCl </li><li> 1 litre H 2 O </li></ul></li><li> Amener le tampon à un pH de 8,4 avec cette solution (10,6 g Na 2 CO 3, 29,2 g de NaCl, 1 litre H 2 0). </li><li> Ajouter 35 ul Atto550 NHS à 70 ul anti-hnRNPA1 et 500 pi de tampon NaHCO 3 et tourner pendant 1 heure à température ambiante. Après la ...

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	<li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse.">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li><li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambert-Eaton+syndrome+antibodies:+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft.">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li><li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTLV-1+induced+molecular+mimicry+in+neurological+disease.">HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).</li><li>Reeves, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.+Antibodies+to+DNA,+DNA-binding+proteins,+and+histones.">Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones.</a> Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).</li><li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+due+to+molecular+mimicry+as+a+cause+of+neurological+disease.">Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease.</a> Nat. Med. 8, 509-513 (2002).</li><li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+that+recognize+functional+domains+of+hnRNPA1+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+neurological+disease.">Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease.</a> Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).</li><li>Kalume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mimicry:+cross-reactive+antibodies+from+patients+with+immune-mediated+neurologic+disease+inhibit+neuronal+firing.">Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing.</a> J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).</li><li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reactivity+between+immunodominant+human+T+lymphotropic+virus+type+I+tax+and+neurons:+implications+for+molecular+mimicry.">Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry.</a> J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).</li><li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+link+between+autoimmunity+and+neurodegeneration+in+immune-mediated+neurological+disease.">A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).</li><li>Smeenk, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies:+cause+of+disease+or+caused+by+disease.">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li><li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease.">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li><li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection.">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li><li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells.">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li><li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer,+Axl,+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases.">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+'passive+transfer'+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen.">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiff,+twitchy+or+wobbly:+are+GAD+antibodies+pathogenic.">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li><li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy.">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li><li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition.">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li></ol>

Afin de tester des hypothèses sur des molécules spécifiques et de leur expression, des gènes et d&#39;autres vecteurs sont couramment transfecté dans des cellules. L&#39;aspect unique de cette procédure est la possibilité de facilement transfecter des anticorps dans les cellules cibles. Nous avons effectué cette méthode dans cinq expériences séparées, chacune en double. Résultats d&#39;efficacité de transfection étaient similaires chez toutes les expériences. Surtout, le procédé permet l&#39;entrée d&...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Fluorescent Microscope AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> AxioVision version 4.2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> Marqué au FITC anti-Rigg </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 ester de NHS </td><td> Sigma </td><td> 92835 </td></tr><tr><td> Ab-DeliverIN </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 +10% FBS antibiotiques +1% </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> Poly-D-Lysine diapositives Culture de 8 puits </td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td> Multi-Purpose Rotator </td><td> Scientifique Industries Inc </td><td> Modèle 151 </td></tr><tr><td> DAPI Montage des médias </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Dialyseur </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 66380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde (solution à 4%) </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis

Anticorps offrir la possibilité d&#39;acquérir un nouvel aperçu de divers événements qui se déroulent dans les systèmes vivants. La capacité à produire des anticorps hautement spécifiques à des protéines cibles a permis de très précis des questions biologiques à traiter. Surtout, les anticorps ont été impliqués dans la pathogenèse de plusieurs maladies humaines, notamment le lupus érythémateux systémique (LES), la polyarthrite rhumatoïde (PR), les syndromes paranéoplasiques, la sclérose en plaques (MS) et humaine de type virus T-lymphotrope 1 (HTLV-1) myélopathie associée / paraparésie spastique tropicale (TSP / HAM) 1-9. Comment anticorps provoquent la maladie est un domaine de recherche en cours et les données suggèrent que les interactions entre les anticorps et les différentes molécules intracellulaires résultats dans l&#39;inflammation, modifié cellulaire de messagerie, et l&#39;apoptose 10. Il a été montré que les patients atteints de SEP et TSP / HAM produire des anticorps contre la protéine intracellulaire d&#39;ARN hétérogène protéine de liaison ribonuclear A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Des données récentes indiquent que les anticorps à la fois intra-neuronale et antigènes de surface sont pathogènes 3, 5-9, 11. Ainsi, une procédure qui permet l&#39;étude des anticorps intracellulaire: les interactions entre protéines donnerait une grande perspicacité dans la pathogenèse des maladies. Les gènes sont souvent transfecté dans des cellules primaires et les lignées cellulaires en culture, mais la transfection d&#39;anticorps dans les cellules a été entravée par la modification de la structure d&#39;anticorps ou de l&#39;efficacité de transfection pauvres 12. D&#39;autres méthodes de transfection comprennent la transfection d&#39;anticorps à base de liposomes cationiques (composés de DOTAP / DOPE) et polyéthylèneimines (PEI), tous deux ce qui a entraîné une diminution de dix fois dans la transfection d&#39;anticorps par rapport aux témoins 12. Le procédé mis en oeuvre dans notre étude est similaire à lipide cationique à médiation méthodes et utilise un mécanisme à base de lipides pour former des complexes non covalents avec des anticorps à travers électrostatique et hydrinteractions ophobic 13. On utilise Ac-DeliverIN réactif, qui est une formulation de lipide capable de capturer des anticorps par des interactions non covalentes électrostatiques et hydrophobes et les délivrer à l&#39;intérieur des cellules. Ainsi, chimiques et génétiques raccords ne sont pas nécessaires pour la livraison des anticorps fonctionnels dans les cellules vivantes. Cette méthode nous a permis d&#39;effectuer des anticorps différents traçage et expériences de localisation de protéines, ainsi que les analyses des conséquences moléculaires de l&#39;anticorps intracellulaire: interactions protéiques 9. Dans ce protocole, nous allons montrer comment pour transfecter des anticorps dans les neurones rapide, reproductible et avec un haut degré d&#39;efficacité de la transfection. A titre d&#39;exemple, nous allons utiliser des anticorps anti-hnRNP A1 et anti-IgG. Pour la quantification facile d&#39;efficacité de la transfection, nous avons utilisé des anticorps anti-hnRNP A1 étiquetés avec Atto-550-NHS et marqué au FITC IgG. Atto550 NHS est un nouveau label avec absorption moléculaire élevé et quantique yield. Source d&#39;excitation et des filtres à fluorescence pour Atto550 sont similaires à Cy3 (Ex. 556 Em. 578). En outre, Atto550 a photostabilité élevée. Marqué au FITC IgG ont été utilisés comme contrôle pour montrer que cette méthode est polyvalent et se teignait pas dépendant. Cette approche et les données qui sont générées aidera à comprendre le rôle que les anticorps à des antigènes cibles intracellulaires pourrait jouer dans la pathogenèse des maladies humaines.

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Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Une réponse rapide pour étudier les interactions et les effets sur les mécanismes moléculaires liés à la présence d&#39;anticorps dans un environnement intracellulaire est décrite. Le procédé comprend la transfection d&#39;anticorps dans des cellules vivantes à l&#39;aide d&#39;une formation de complexe non covalent sur la base d&#39;une formulation de lipide. La technique est adaptable à des lignées de cellules immortalisées et des cellules primaires.

La transfection d&#39;anticorps dans les neurones comme outil pour étudier la pathogenèse des maladies

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Research

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Microdissection laser des Drosophile Neurones périphériques

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Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Coupez-chargement: Un outil utile pour examiner l&#39;étendue du couplage Tracer Gap jonction entre neurones rétiniens

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Analyseur portable à base d&#39;impédance en temps réel comme un outil pour délimiter voies moléculaires impliquées dans la neurotoxicité et la neuroprotection dans une lignée cellulaire neuronale

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

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Le système olfactif comme un modèle pour étudier des modèles axonale croissance et la morphologie<em&gt; In Vivo</em

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Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Les injections intramusculaires le long des plaques motrices de fin: une approche minimalement invasive à la navette Tracers Directement dans motoneurones

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Assay pour étudier l&#39;activité attractive ou répulsive d&#39;un substrat protéique utilisant dissociées hippocampique Neurones

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Hippocampe organotypiques comme modèle d’étude Neuroprotection et son caractère invasif des cellules tumorales

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Administration exogène d’Alpha-synucléine Microsomes associées aux agrégats de neurones primaires comme un modèle de cellulaire puissant de la Formation de fibrilles

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Cell-based Assay pour étudier la clairance Tau humoral de la microglie

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...