Name: antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00
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Diese Arbeit wird durch das Office of Research and Development, Medical Research Service, Department of Veterans Affairs unterstützt. Diese Studie wurde von einer VA Merit Review Award (MCL) und der University of Tennessee Health Science Center Multiple Sclerosis Research Fund finanziert.

Ein. Antibody Labeling (Abbildung 1) <ol><li> Machen 0,1 M NaHCO 3-Puffer: <ul type="circle"><li> 8,4 g NaHCO 3 </li><li> 29,2 g NaCl </li><li> 1 Liter H 2 O </li></ul></li><li> Bringen der Puffer bis zu einem pH von 8,4 mit dieser Lösung (10,6 g Na 2 CO 3, 29,2 g NaCl, 1 Liter H 2 0). </li><li> Fügen Sie 35 ul Atto550 NHS bis 70 ul anti-hnRNPA1 und 500 ul NaHCO 3-Puffer und drehen für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach dem einstündigen Ro...

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	<li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse.">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li><li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambert-Eaton+syndrome+antibodies:+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft.">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. 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Lett. 401, 188-193 (2006).</li><li>Kalume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mimicry:+cross-reactive+antibodies+from+patients+with+immune-mediated+neurologic+disease+inhibit+neuronal+firing.">Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing.</a> J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).</li><li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reactivity+between+immunodominant+human+T+lymphotropic+virus+type+I+tax+and+neurons:+implications+for+molecular+mimicry.">Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry.</a> J. Infect. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies:+cause+of+disease+or+caused+by+disease.">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li><li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease.">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li><li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection.">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li><li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells.">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li><li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer,+Axl,+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases.">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+'passive+transfer'+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen.">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiff,+twitchy+or+wobbly:+are+GAD+antibodies+pathogenic.">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li><li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy.">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li><li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition.">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li></ol>

Um Hypothesen über spezifische Moleküle und deren Expression zu testen, werden Gene und andere Vektoren üblicherweise in Zellen transfiziert. Die Besonderheit dieses Verfahrens ist die Fähigkeit, leicht transfizieren Antikörper in Zielzellen. Wir führten diese Methode in fünf getrennten Experimenten jeweils in Duplikaten. Transfektionseffizienz Ergebnisse waren ähnlich bei allen Experimenten. Insbesondere erlaubt der Verfahrenseintrag von Antikörpern in die Zelle ohne Veränderung Antikörper Struktur oder Funk...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Axiovision Version 4.2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> FITC markierten Anti-Rigg </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 NHS-Ester </td><td> Sigma </td><td> 92835 </td></tr><tr><td> Ab-deliverin </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 10% FBS 1% Antibiotika </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin-8-Well-Kultur Slides </td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td> Multi-Purpose Rotator </td><td> Scientific Industries Inc </td><td> Modell 151 </td></tr><tr><td> DAPI Mounting Medien </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Dialysator </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 66380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd (4% ige Lösung) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis

Antikörper bieten die Möglichkeit, neue Einblicke in die verschiedenen Ereignisse in lebenden Systemen zu gewinnen. Die Fähigkeit, hochspezifische Antikörper zu produzieren Zielproteine ​​wurde für sehr präzise biologischer Fragestellungen gelassen adressiert werden. Wichtigerweise haben Antikörper in die Pathogenese einer Reihe von menschlichen Erkrankungen, einschließlich systemischem Lupus erythematodes (SLE), rheumatoider Arthritis (RA), paraneoplastischen Syndromen, Multiple Sklerose (MS) und menschlichen T-lymphotropen Virus Typ 1 (HTLV-1) in Verbindung gebracht assoziierte Myelopathie / tropische spastische Paraparese (HAM / TSP) 1-9. Wie Krankheiten verursachen Antikörper ist ein Bereich der laufenden Untersuchung und Daten nahe, dass Wechselwirkungen zwischen Antikörpern und verschiedene intrazelluläre Moleküle führt zu Entzündung, zellulärer verändert Messaging und Apoptose 10. Es hat sich gezeigt, dass Patienten mit MS und HAM / TSP Autoantikörper produzieren, um die intrazelluläre RNA-Bindeprotein heterogenen ribonuclear Protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Neuere Daten weisen darauf hin, dass Antikörper, sowohl Intra-neuronale und Oberflächenantigene pathogenen 3, 5-9, 11 sind. So ein Verfahren, das für die Untersuchung der intrazellulären Antikörpers ermöglicht: Protein Interaktionen würde großen Einblick in Krankheitsentstehung verleihen. Gene häufig in primären Zellen und Zelllinien in Kultur transfiziert wurde jedoch Transfektion von Antikörpern in Zellen durch Änderung des Antikörpers Struktur oder schlechte Transfektionseffizienz 12 behindert. Andere Transfektionsmethoden sind Antikörper Transfektion auf kationischen Liposomen (bestehend aus DOTAP / DOPE) und Polyethylenimine (PEI) bezogen, welche beide in einem Zehn-fache Abnahme der Antikörper Transfektion resultierte, verglichen mit Kontrollen 12. Das Verfahren unserer Studie durchgeführt ähnelt kationische Lipid-vermittelte Methoden und verwendet eine Lipid-basierten Mechanismus zur nicht-kovalente Komplexe mit den Antikörpern zu bilden, durch elektrostatische und hydrophobic Wechselwirkungen 13. Wir verwendeten Ab-deliverin Reagenz, das eine Lipidformulierung einfangen kann Antikörper durch nichtkovalente elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen und liefert sie innerhalb der Zellen ist. So chemischen und genetischen Kupplungen sind nicht notwendig für die Lieferung von funktionellen Antikörpern in lebenden Zellen. Dieses Verfahren ermöglichte es uns, führen verschiedene Antikörper Tracing und Proteinlokalisierung Versuche sowie die Analysen der molekularen Folgen von intrazellulären Antikörper: Protein Wechselwirkungen 9. In diesem Protokoll wird gezeigt, wie an Antikörper zu Neuronen transfizieren rasch, reproduzierbar und mit einem hohen Grad der Transfektionseffizienz. Als ein Beispiel verwenden wir anti-hnRNP A1 und Anti-IgG-Antikörpern. Für die einfache Quantifizierung der Transfektionseffizienz verwendet man Anti-Antikörper mit hnRNP A1 Atto-550-NHS und FITC-markierten-IgG markiert. Atto550 NHS ist ein neues Label mit hochmolekularen Absorption und Quanten-yield. Anregungsquelle und fluoreszierenden Filter für Atto550 ähneln Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Darüber hinaus hat Atto550 hohe Photostabilität. FITC-markiertes IgG wurden als Kontrolle verwendet, um anzuzeigen, dass dieses Verfahren vielseitig und nicht färben abhängig ist. Dieser Ansatz und die Daten, die erzeugt wird Verständnis der Rolle, dass Antikörper gegen Zielantigene intrazelluläre könnte in der Pathogenese von Erkrankungen des Menschen spielen, zu unterstützen.

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Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Eine schnelle Annäherung an Interaktionen und Wirkungen auf molekularer Mechanismen in Bezug auf die Anwesenheit von Antikörpern in einer intrazellulären Umgebung untersucht wird beschrieben. Das Verfahren beinhaltet die Transfektion von Antikörpern in lebende Zellen mit einem nicht-kovalenten Komplex-Bildung auf einem Lipid Formulierung. Die Technik ist anpassbar an immortalisierten Zelllinien und primäre Zellen.

Antikörper Transfektion in Neuronen als Werkzeug zur Pathogenese der Erkrankung Studieren

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-loading: ein nützliches Werkzeug für die Prüfung des Umfangs der Gap Junction Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Echtzeit-Impedanz-basierte Zellanalyse als Werkzeug, um molekulare Signalwege in Neurotoxizität und Neuroprotektion in einem neuronalen Zelllinie; Delineate

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Intramuskuläre Injektionen Entlang der motorischen Endplatten: eine minimal-invasive Ansatz zur Shuttle Tracers Direkt in Motoneuronen

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Assay die anziehende oder abstoßende Aktivität eines Proteins Substrat unter Verwendung Dissociated Neuronen im Hippocampus zu studieren

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Exogene Verabreichung von Alpha-Synuclein Microsomen verbundenen Aggregate zur primären Neuronen als eine mächtige Zellmodell der Fibrillen Bildung

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Zellbasierte Assays, Antikörper-vermittelten Tau Clearance von Mikroglia zu studieren

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...