Name: antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי משרד המחקר והפיתוח, מחקר רפואי שירות, מחלקה לענייני יוצאי הצבא. מחקר זה מומן בפרס הצטיינות VA סקירה (לMCL) ואוניברסיטת טנסי קרן למדעי בריאות במרכז לחקר טרשת נפוצה על ידי.

1. תיוג נוגדן (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 0.1 3 חיץ NaHCO M: <ul type="circle" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 8.4 גרם NaHCO 3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 29.2 גרם NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 הליטר H 2 O </li></ul></li><li style=";text-alig...

<ol>
	<li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse.">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li><li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambert-Eaton+syndrome+antibodies:+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft.">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li><li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTLV-1+induced+molecular+mimicry+in+neurological+disease.">HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).</li><li>Reeves, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.+Antibodies+to+DNA,+DNA-binding+proteins,+and+histones.">Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones.</a> Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).</li><li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+due+to+molecular+mimicry+as+a+cause+of+neurological+disease.">Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease.</a> Nat. Med. 8, 509-513 (2002).</li><li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+that+recognize+functional+domains+of+hnRNPA1+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+neurological+disease.">Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease.</a> Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).</li><li>Kalume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mimicry:+cross-reactive+antibodies+from+patients+with+immune-mediated+neurologic+disease+inhibit+neuronal+firing.">Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing.</a> J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).</li><li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reactivity+between+immunodominant+human+T+lymphotropic+virus+type+I+tax+and+neurons:+implications+for+molecular+mimicry.">Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry.</a> J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).</li><li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+link+between+autoimmunity+and+neurodegeneration+in+immune-mediated+neurological+disease.">A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).</li><li>Smeenk, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies:+cause+of+disease+or+caused+by+disease.">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li><li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease.">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li><li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection.">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li><li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells.">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li><li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer,+Axl,+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases.">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+'passive+transfer'+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen.">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiff,+twitchy+or+wobbly:+are+GAD+antibodies+pathogenic.">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li><li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy.">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li><li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition.">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li></ol>

על מנת לבדוק את ההשערות לגבי מולקולות ספציפיות וביטוייהם, גנים ווקטורים אחרים transfected נפוץ לתוך תאים. ההיבט הייחודי של הליך זה הוא היכולת בקלות transfect נוגדנים לתאי המטרה. בצענו בשיטה זו בחמישה ניסויים נפרדים, כל אחד בכפילויות. תוצאות יעילות transfection היו דומות בכל הניסויי?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלורסנט AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> AxioVision גרסת 4.2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> אנטי rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> FITC מתויג אנטי ריג </td><td> העוז Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 NHS אסטר </td><td> סיגמא </td><td> 92835 </td></tr><tr><td> Ab-סחורה ב </td><td> העוז Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 +10% FBS אנטיביוטיקת 1% </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> פולי-D-ליזין שקופיות תרבות 8-כן </td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td> Rotator רב תכליתי </td><td> המדעי Industries Inc </td><td> דגם 151 </td></tr><tr><td> DAPI הרכבת מדיה </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Dialyzer </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td> 66380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (פתרון 4%) </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop </td><td> תרם הפישר סיינטיפיק </td><td></td></tr></tbody></table>

antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis

נוגדנים לספק את היכולת לקבל תובנה רומן לאירועים שונים המתרחשים במערכות חיים. היכולת לייצר נוגדנים ספציפיים מאוד לחלבוני היעד אפשרה לשאלות ביולוגיות מדויקות מאוד להתייחסות. חשוב לציין, הנוגדנים היו מעורבים בפתוגנזה של מספר המחלות אנושיות לרבות זאבת מערכתית (לופוס), דלקת מפרקים שגרוניים (RA), תסמונות paraneoplastic, טרשת נפוצה (MS) וטיפוס אנושי T-lymphotropic וירוס 1 (HTLV-1) קשור myelopathy / paraparesis ספסטית הטרופית (HAM / כפית) 1-9. איך לגרום למחלה היא נוגדני שטח של חקירה מתמשכת, והנתונים מצביעים על כך שאינטראקציות בין מולקולות נוגדנים ותוצאות תאיות שונות בדלקת, שינו סלולריים הודעות, ואפופטוזיס 10. הוכח כי חולים עם טרשת נפוצה וHAM / TSP לייצר נוגדנים עצמיים לחלבונים התאיים RNA מחייבים חלבונים הטרוגנית ribonuclear1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. הנתונים האחרונים מצביעים על כך נוגדנים לאנטיגנים משטח תוך עצבי ושניהם פתוגניים 3, 5-9, 11. לפיכך, הליך המאפשר לחקר נוגדנים תאיים: אינטראקציות חלבון הייתי משאיל תובנה גדולה להיווצרות מחלה. גני transfected נפוץ לתוך תאים ראשוניים וקווים סלולריים בתרבות, לעומת זאת transfection של נוגדנים לתאים התעכב בשל שינוי של מבנה נוגדנים או יעילות transfection עניה 12. שיטות אחרות של transfection כוללות transfection נוגדן המבוסס על יפוזומים קטיוני (מורכב DOTAP / סמים) וpolyethylenimines (PEI); שניהם גרמו לירידה של פי עשרה בtransfection נוגדן השוואה לקבוצת ביקורת 12. השיטה מבוצעת במחקר שלנו היא דומה לשיטות קטיוני שומנים בתיווך ומשתמשת במנגנון מבוסס שומנים ליצירת קומפלקסים שאינם קוולנטיים עם הנוגדנים דרך אלקטרוסטטי וhydrאינטראקציות ophobic 13. אנו מנוצלים מגיבים Ab-סחורה ב, שהוא ניסוח שומנים מסוגל ללכוד נוגדנים דרך אינטראקציות אלקטרוסטטיות והידרופובי שאינם קוולנטיים ואספקתם בתוך תאים. לפיכך כימי וגנטיים זיווגים אינם הכרחיים עבור משלוח של נוגדנים פונקציונליים לתוך תאי חיים. שיטה זו אפשרה לנו לבצע מעקב נוגדנים שונים וניסויי חלבון לוקליזציה, כמו גם את הניתוח של ההשלכות המולקולריות של נוגדנים תאיים: אינטראקציות חלבון 9. בפרוטוקול זה, אנו נראים כיצד transfect נוגדנים לנוירונים במהירות, reproducibly ועם רמה גבוהה של יעילות transfection. כדוגמה, ישתמשו נוגדני A1 ואנטי IgG נגד hnRNP. לכימות קל של יעילות transfection השתמשנו נוגדני A1 אנטי hnRNP כותרתו עם ATTO-550-NHS וFITC שכותרת IgG. Atto550 NHS הוא תווית חדשה עם ספיגה מולקולרית גבוהה והקוונטים ייישן. מקור עירור ומסנני ניאון לAtto550 דומה לCy3 (שמות 556 Em. 578). בנוסף, יש Atto550 photostability גבוה. FITC מתויג-IgG שמש כבקרה כדי להראות ששיטה זו היא תכליתית ולא לצבוע תלוי. גישה זו והנתונים שיופקו תסייענה בהבנה של התפקיד שנוגדנים לאנטיגנים תאיים היעד עשויים לשחק בפתוגנזה של מחלות בבני אדם.

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis at JoVE.com

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

גישה מהירה כדי לחקור אינטראקציות והשפעות על מנגנונים מולקולריים הקשורים לנוכחות של נוגדנים בסביבה תאית מתוארת. השיטה כרוכה transfection של נוגדנים לתאים חיים באמצעות היווצרות מורכבת שאינן קוולנטיים המבוססת על ניסוח שומנים בדם. הטכניקה ניתנת להתאמה לשורות תאים הנציחו ותאים ראשוניים.

Transfection נוגדן לנוירונים ככלי ללימוד פתוגנזה מחלות

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-טעינה: כלי שימושי לבחינת היקף Coupling צומת גאפ נותב בין הנוירונים רשתית

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Analyzer הנייד מבוססת עכבה בזמן אמת ככלי להתוות מסלולים מולקולריים מעורבים ברעילות העצבית וneuroprotection בקו תאים עצבי

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

זריקות לשריר לאורך צלחות מוטוריות סיום: גישה פולשנית להסעות קליעים נותבים ישירות לתוך מנוע נוירונים

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Assay לחקר פעילות דוחה או מושך של מצע חלבון באמצעות ניתק נוירונים בהיפוקמפוס

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

הממשל אקסוגני של אלפא-synuclein Microsomes-הקשורים אגרגטים כדי נוירונים העיקרי כמודל תא עוצמה היווצרות הסיבים

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

מבוססת תא Assay ללמוד טאו בתיווך נוגדנים אישור מאת מיקרוגלייה

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...