Name: antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00
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Questo lavoro è supportato dall&#39;Ufficio di Ricerca e Sviluppo, Ricerca medica Service, Department of Veterans Affairs. Questo studio è stato finanziato da un premio VA recensione Merit (per MCL) e la University of Tennessee Health Science Fondo sclerosi multipla Research Center.

1. Anticorpo Labeling (Figura 1) <ol><li> Fai 0.1 M NaHCO 3 buffer: <ul type="circle"><li> 8,4 g NaHCO 3 </li><li> 29,2 g NaCl </li><li> 1 litro H 2 O </li></ul></li><li> Portare il buffer fino ad un pH di 8,4 con questa soluzione (10,6 g di Na 2 CO 3, 29,2 g di NaCl, 1 litro H 2 0). </li><li> Aggiungere 35 ul Atto550 NHS a 70 pl pl NaHCO anti-hnRNPA1 e 500 3 tampone e ruotarlo per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo un&#39;ora di rotazione, i...

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	<li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse.">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li><li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambert-Eaton+syndrome+antibodies:+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft.">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li><li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTLV-1+induced+molecular+mimicry+in+neurological+disease.">HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).</li><li>Reeves, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.+Antibodies+to+DNA,+DNA-binding+proteins,+and+histones.">Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones.</a> Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).</li><li>Levin, M. 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Lett. 401, 188-193 (2006).</li><li>Kalume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mimicry:+cross-reactive+antibodies+from+patients+with+immune-mediated+neurologic+disease+inhibit+neuronal+firing.">Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing.</a> J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).</li><li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reactivity+between+immunodominant+human+T+lymphotropic+virus+type+I+tax+and+neurons:+implications+for+molecular+mimicry.">Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry.</a> J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).</li><li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+link+between+autoimmunity+and+neurodegeneration+in+immune-mediated+neurological+disease.">A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).</li><li>Smeenk, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies:+cause+of+disease+or+caused+by+disease.">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li><li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease.">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li><li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection.">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li><li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells.">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li><li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer,+Axl,+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases.">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+'passive+transfer'+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen.">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiff,+twitchy+or+wobbly:+are+GAD+antibodies+pathogenic.">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li><li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy.">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li><li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition.">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li></ol>

Al fine di verificare ipotesi circa molecole specifiche e la loro espressione, altri geni e vettori sono comunemente trasfettati in cellule. L&#39;aspetto unico di questo procedimento è la possibilità di trasfettare facilmente anticorpi nelle cellule bersaglio. Abbiamo eseguito questo metodo in cinque esperimenti separati ciascuno in duplicati. Risultati di efficienza di trasfezione erano simili in tutti gli esperimenti. Soprattutto, il metodo permette l&#39;inserimento di anticorpi nella cellula senza alterare la str...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Fluorescente Microscopio AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> AxioVision versione 4.2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> Marcato con FITC anti-Rigg </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 NHS estere </td><td> Sigma </td><td> 92835 </td></tr><tr><td> Ab-DeliverIN </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 +10% FBS antibiotici +1% </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> Poly-D-Lisina 8 pozzetti Cultura Slides </td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td> Multi-Purpose Rotator </td><td> Scientifico Industries Inc </td><td> Modello 151 </td></tr><tr><td> DAPI Montaggio supporti </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Dializzatore </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 66380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldeide (4% soluzione) </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis

Anticorpi fornire la capacità di ottenere informazioni romanzo in vari eventi che si svolgono in sistemi viventi. La capacità di produrre anticorpi altamente specifici per le proteine ​​bersaglio ha consentito di questioni biologiche molto precise da affrontare. Soprattutto, gli anticorpi sono stati implicati nella patogenesi di numerose malattie umane comprendenti lupus eritematoso sistemico (SLE), artrite reumatoide (RA), sindromi paraneoplastiche, sclerosi multipla (SM) e umane T linfotropico virus di tipo 1 (HTLV-1) mielopatia associata / paraparesi spastica tropicale (HAM / TSP) 1-9. Come anticorpi causano la malattia è una zona di un&#39;indagine in corso, ed i dati suggeriscono che le interazioni tra gli anticorpi e molecole intracellulari vari risultati in infiammazione, alterazione cellulare di messaggistica, e l&#39;apoptosi 10. E &#39;stato dimostrato che i pazienti con SM e HAM / TSP produrre autoanticorpi al intracellulare di RNA binding protein proteine ​​eterogenee ribonuclear A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Dati recenti indicano che gli anticorpi per intra-neuronale e antigeni di superficie sono patogeni 3, 5-9, 11. Pertanto, un procedimento che consente lo studio di anticorpo intracellulare: proteina presterebbe grande intuizione patogenesi della malattia. I geni sono comunemente trasfettati in cellule primarie e linee cellulari in coltura, tuttavia trasfezione in cellule di anticorpi è stato ostacolato dalla alterazione della struttura anticorpo o scarsa efficienza di transfezione 12. Altri metodi di trasfezione includono trasfezione anticorpo basato su liposomi cationici (costituito DOTAP / DOPE) e polyethylenimines (PEI), entrambi i quali ha determinato un decremento di dieci volte nella trasfezione anticorpo rispetto ai controlli 12. Il metodo eseguito nel nostro studio è simile a lipidi cationici-mediate metodi e utilizza una base lipidica meccanismo per formare non covalenti complessi con gli anticorpi attraverso elettrostatica e hydrinterazioni ophobic 13. Abbiamo utilizzato Ab-DeliverIN reattivo, che è una formulazione lipidica in grado di catturare anticorpi attraverso interazioni elettrostatiche e idrofobi non-covalenti e depositarli all&#39;interno delle cellule. Così chimica e genetica accoppiamenti non sono necessari per la consegna di anticorpi funzionali nelle cellule viventi. Questo metodo ci ha permesso di eseguire l&#39;analisi degli anticorpi vari esperimenti e localizzazione della proteina, così come le analisi delle conseguenze molecolari di anticorpi intracellulari: interazioni delle proteine ​​9. In questo protocollo, si mostrerà come trasfettare anticorpi in neuroni rapida, riproducibile e con un elevato grado di efficienza di trasfezione. A titolo di esempio, useremo anticorpi anti-hnRNP A1 e anti-IgG. Per la quantificazione facile di efficienza di trasfezione abbiamo utilizzato anticorpi anti-A1 hnRNP etichettati con Atto-550-NHS e marcato con FITC IgG. Atto550 NHS è una nuova etichetta ad alto assorbimento molecolare e quantistica yiELD. Fonte di eccitazione e filtri fluorescenti per Atto550 sono simili a Cy3 (Es. 556 Em. 578). Inoltre, Atto550 ha fotostabilità alta. Marcato con FITC IgG sono stati utilizzati come controllo per dimostrare che questo metodo è versatile e non tingere dipendente. Questo approccio e i dati generati aiuterà nella comprensione del ruolo che gli anticorpi per antigeni bersaglio intracellulare potrebbe svolgere nella patogenesi delle malattie umane.

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Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Un approccio rapido per investigare le interazioni e gli effetti sui meccanismi molecolari legati alla presenza di anticorpi in un ambiente intracellulare viene descritto. Il metodo comporta la transfezione di anticorpi nelle cellule vive utilizzando un non-covalente formazione del complesso basato su una formulazione lipidica. La tecnica è adattabile a linee cellulari immortalizzate e cellule primarie.

Trasfezione anticorpo in neuroni come strumento per studiare patogenesi della malattia

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

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Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Ricerca

Neuroscienze

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-loading: uno strumento utile per esaminare fino di accoppiamento Tracer Junction Gap tra i neuroni della retina

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Fosfato di calcio trasfezione di primaria neuroni dell&#39;ippocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Cell Analyzer a base di impedenza in tempo reale come strumento per delineare molecolari meccanismi coinvolti nella neurotossicità e neuroprotezione in una linea cellulare neuronale

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Il sistema olfattivo come modello per studiare gli schemi di crescita assonale e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Iniezioni intramuscolari Lungo le piastre Motor finale: un approccio mini-invasivo di navetta Tracers Direttamente nella Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Assay per studiare l&#39;attività attrattiva o repulsiva di un substrato proteico Utilizzando dissociata neuroni dell&#39;ippocampo

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Colture Hippocampal Fetta organotipiche come modello di studio Neuroprotection e l'invasività delle cellule del tumore

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Somministrazione esogena di microsomi-collegato dell'alfa-synuclein aggregati di neuroni primari come un modello potente delle cellule di formazione di fibrille

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Cell-based test per studiare la Clearance di Tau anticorpo-mediato da Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...