Name: antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis at JoVE.com

Dette arbeidet støttes av Office of Research and Development, Medical Research Service, Department of Veterans Affairs. Denne studien ble finansiert av en VA Merit anmeldelse Award (til MCL) og University of Tennessee Health Science Center Multippel sklerose forskningsfond.

1. Antibody Labeling (Figur 1) <ol><li> Gjør 0,1 M NaHCO 3 buffer: <ul type="circle"><li> 8,4 g NaHCO 3 </li><li> 29,2 g NaCl </li><li> 1 liter H 2 O </li></ul></li><li> Bring bufferen opp til en pH på 8,4 med denne løsning (10,6 g Na 2 3 CO, 29,2 g NaCl, 1 liter H 2 0). </li><li> Legg 35 ul Atto550 NHS til 70 pl anti-hnRNPA1 og 500 pl NaHCO 3 buffer og roterer i 1 time ved romtemperatur. Etter den timelange rotasjon, injiserer blandingen i en dialyz...

<ol>
	<li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse.">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li><li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambert-Eaton+syndrome+antibodies:+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft.">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li><li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTLV-1+induced+molecular+mimicry+in+neurological+disease.">HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).</li><li>Reeves, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.+Antibodies+to+DNA,+DNA-binding+proteins,+and+histones.">Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones.</a> Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).</li><li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+due+to+molecular+mimicry+as+a+cause+of+neurological+disease.">Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease.</a> Nat. Med. 8, 509-513 (2002).</li><li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+that+recognize+functional+domains+of+hnRNPA1+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+neurological+disease.">Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease.</a> Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).</li><li>Kalume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mimicry:+cross-reactive+antibodies+from+patients+with+immune-mediated+neurologic+disease+inhibit+neuronal+firing.">Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing.</a> J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).</li><li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reactivity+between+immunodominant+human+T+lymphotropic+virus+type+I+tax+and+neurons:+implications+for+molecular+mimicry.">Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry.</a> J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).</li><li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+link+between+autoimmunity+and+neurodegeneration+in+immune-mediated+neurological+disease.">A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).</li><li>Smeenk, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies:+cause+of+disease+or+caused+by+disease.">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li><li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease.">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li><li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection.">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li><li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells.">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li><li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer,+Axl,+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases.">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+'passive+transfer'+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen.">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiff,+twitchy+or+wobbly:+are+GAD+antibodies+pathogenic.">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li><li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy.">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li><li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition.">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li></ol>

For å teste hypoteser om spesifikke molekyler og deres uttrykk blir gener og andre vektorer som vanligvis transfektert inn i cellene. Det unike med denne prosedyren er muligheten til enkelt transfektere antistoffer i målcellene. Vi utførte denne metoden i fem separate eksperimenter hver i duplikater. Transfeksjon effektivitet resultatene var lik blant alle eksperimenter. Viktigere, muliggjør metoden oppføring av antistoffer inn i cellen uten å endre antistoff struktur eller funksjon. Videre, med bruk av fluorescen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på Reagens </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Fluorescerende mikroskop AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Axiovision versjon 4.2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> FITC merket anti-Rigg </td><td> OZ biovitenskap </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 NHS ester </td><td> Sigma </td><td> 92835 </td></tr><tr><td> Ab-DeliverIN </td><td> OZ biovitenskap </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 10% FBS +1% antibiotika </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> Poly-D-lysin 8-vel kultur Slides </td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td> Multi-Purpose Rotator </td><td> Scientific Industries Inc </td><td> Modell 151 </td></tr><tr><td> DAPI Mounting Media </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Dialyzer </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 66380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd (4% oppløsning) </td><td> Elektronmikroskopi Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis

Antistoffer gi muligheten til å få romanen innsikt i ulike arrangementer som finner sted i levende systemer. Evnen til å produsere svært spesifikke antistoffer mot target proteiner har åpnet for svært presise biologiske spørsmål tas opp. Viktigere, har antistoffer vært implisert i patogenesen av en rekke humane sykdommer inkludert systemisk lupus erythematosus (SLE), revmatoid artritt (RA), paraneoplastiske syndromer, multippel sklerose (MS) og human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) assosiert myelopati / tropisk spastisk paraparese (HAM / TSP) 1-9. Hvordan antistoffer forårsake sykdom er et område med pågående etterforskning, og data tyder på at interaksjoner mellom antistoffer og ulike intracellulære molekyler resultater i betennelser, endret cellulær messaging, og apoptose 10. Det har blitt vist at pasienter med MS og HAM / TSP produserer autoantistoffer til det intracellulære RNA bindingsprotein heterogen ribonuclear protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Nyere data indikerer at antistoffer til både intra-neuronal og overflateantigener er sykdomsfremkallende 3, 5-9, 11. Dermed, en prosedyre som gjør det mulig for studiet av intracellulær antistoff: ville protein interaksjoner låne stor innsikt i sykdommen patogenesen. Gener er ofte transfekteres i primære celler og cellelinjer i kultur, har imidlertid transfeksjon av antistoffer i celler blitt hindret av endring av antistoff struktur eller dårlig transfeksjon effektivitet 12. Andre metoder for transfeksjon er antistoff transfeksjon basert på kationiske liposomer (bestående av DOTAP / DOPE) og polyethylenimines (PEI), som begge som resulterte i en ti-ganger reduksjon i antistoff transfeksjon forhold til kontroller 12. Metoden utføres i vår undersøkelse er lik kationiske lipid-medierte metoder og benytter et lipid-basert mekanisme for å danne ikke-kovalente komplekser med antistoffer gjennom elektrostatisk og hydrophobic interaksjoner 13. Vi utnyttet Ab-DeliverIN reagens, som er et lipid formulering som kan fange antistoffer gjennom ikke-kovalente elektrostatiske og hydrofobe interaksjoner og levere dem inne i celler. Således kjemisk og genetisk koblinger er ikke nødvendig for levering av funksjonelle antistoffer i levende celler. Denne metoden har gitt oss mulighet til å utføre ulike antistoff sporing og protein lokalisering eksperimenter, samt analyser av de molekylære konsekvensene av intracellulær antistoff: protein interaksjoner 9. I denne protokollen, vil vi vise hvordan du transfektere antistoffer i nevroner raskt, reproduserbart og med en høy grad av transfeksjon effektivitet. Som et eksempel vil vi bruke anti-hnRNP A1 og anti-IgG antistoffer. For enkel kvantifisering av transfeksjon effektivitet brukte vi anti-hnRNP A1 antistoffer merket med Atto-550-NHS og FITC-merket IgG. Atto550 NHS er en ny etikett med høy molekylvekt absorpsjon og quantum yield. Eksitasjon kilde og fluorescerende filtre for Atto550 ligner Cy3 (eks. 556 Em. 578). I tillegg har Atto550 høy fotostabilitet. FITC-merket IgG ble brukt som en kontroll for å vise at denne metoden er allsidig og ikke fargestoff avhengige. Denne tilnærmingen og dataene som er generert vil bistå i forståelse av rollen som antistoffer til intracellulære mål antigener kan spille i patogenesen av menneskelige sykdommer.

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis at JoVE.com

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

En rask metode for å undersøke interaksjoner og effekter på molekylære mekanismene knyttet til nærværet av antistoffer i en intracellulær miljø er beskrevet. Fremgangsmåten innebærer transfeksjon av antistoffer i levende celler ved hjelp av et ikke-kovalent kompleks formasjon basert på en lipid formulering. Teknikken er tilpasningsdyktig til udødeliggjort cellelinjer og primære celler.

Antistoff Transfeksjon inn Neurons som verktøy for å studere sykdom Patogenese

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-lasting: et nyttig verktøy for å undersøke graden av Gap Junction Tracer kobling mellom Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Kalsium Fosfat Transfection of Primary hippocampus nevroner

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Real-Time Impedans-baserte Cell Analyzer som et verktøy å avgrense molekylære stier involvert i Neurotoksisitet og nevro i en Neuronal cellelinje

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Luktsystemet som en modell for å studere aksonal vekst mønstre og morfologi<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Intramuskulære injeksjoner Langs Motor endeplatene: en minimal invasiv tilnærming til Shuttle Tracers Direkte inn motoriske nerveceller

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe-analyse for å studere attraktiv eller frastøtende aktivitet av et protein underlaget med Spaltet hippocampus nevroner

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic hippocampus skive kulturer som en modell å studere Neuroprotection og Invasiveness av kreftceller

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Eksogene administrasjon av Microsomes-assosiert Alpha-synuclein-aggregater til primære Neurons som kraftig celle modell Fibrils formasjonen

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Cellebasert analysen å studere antistoff-mediert Tau godkjennes av Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...