Name: antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00
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Este trabalho é apoiado pelo Escritório de Investigação e Desenvolvimento, Pesquisa Médica de Serviço, Departamento de Assuntos de Veteranos. Este estudo foi financiado por uma Prêmio Mérito VA Review (a MCL) e da Universidade do Tennessee, Centro de Ciências da Saúde Fundo de Investigação de Esclerose Múltipla.

1. Etiquetagem de anticorpos (Figura 1) <ol><li> Fazer NaHCO3 0,1 M de tampão: <ul type="circle"><li> 8,4 g de NaHCO3 </li><li> 29,2 g de NaCl </li><li> 1 litro de H 2 O </li></ul></li><li> Traga o tampão até um pH de 8,4 com esta solução (10,6 g de Na 2 CO 3, 29,2 g de NaCl, 1 litro de H 2 0). </li><li> Adicionar 35 ul de Atto550 NHS a 70 ul de anti-ul NaHCO hnRNPA1 e 500 3-tampão e girar durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a...

<ol>
	<li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse.">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li><li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambert-Eaton+syndrome+antibodies:+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft.">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li><li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTLV-1+induced+molecular+mimicry+in+neurological+disease.">HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).</li><li>Reeves, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.+Antibodies+to+DNA,+DNA-binding+proteins,+and+histones.">Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones.</a> Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).</li><li>Levin, M. 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Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li><li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection.">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li><li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells.">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li><li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer,+Axl,+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases.">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+'passive+transfer'+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen.">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiff,+twitchy+or+wobbly:+are+GAD+antibodies+pathogenic.">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li><li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy.">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. 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A fim de testar hipóteses sobre moléculas específicas e sua expressão, genes e outros vectores normalmente são transfectados em células. O único aspecto deste processo é a capacidade de facilmente anticorpos para transfectar as células alvo. Realizamos este método em cinco experimentos em separado cada um em duplicatas. Resultados de eficiência de transfecção foram semelhantes entre todos os experimentos. É importante notar que o método permite a introdução de anticorpos para dentro da célula, sem alte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Microscópio fluorescente AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Axiovision versão 4.2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> FITC anti-Rigg </td><td> OZ Biociências </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 NHS éster </td><td> Sigma </td><td> 92835 </td></tr><tr><td> Ab-deliverin </td><td> OZ Biociências </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 +10% FBS antibióticos 1% </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> Poli-D-lisina-8 assim Slides Cultura </td><td> BD </td><td> 354632 </td></tr><tr><td> Multi-Purpose Rotator </td><td> Scientific Industries Inc </td><td> Modelo 151 </td></tr><tr><td> DAPI montar mídia </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Dialisador </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 66380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldeído (solução a 4%) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis

Anticorpos fornecem a capacidade de ter uma visão romance em vários eventos que ocorrem em sistemas vivos. A capacidade de produzir anticorpos altamente específicos para proteínas alvo tem permitido muito precisas questões biológicas a ser tratada. É importante notar que os anticorpos têm sido implicados na patogénese de várias doenças humanas, incluindo o lúpus eritematoso sistémico (SLE), artrite reumatóide (RA), as síndromes paraneoplásicas, a esclerose múltipla (MS) e o tipo de vírus T-linfotrópico humano 1 (HTLV-1) mielopatia associada ao / paraparesia espástica tropical (HAM / TSP) 1-9. Como anticorpos causam a doença é uma área de investigação em curso, e os dados sugerem que as interacções entre vários anticorpos e moléculas intracelulares resultados na inflamação, alterados celular, mensagens e apoptose 10. Tem sido demonstrado que os pacientes com EM e HAM / TSP produzir anticorpos para a proteína de ligação intracelular de proteínas RNA heterogéneo ribonuclear A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Dados recentes indicam que os anticorpos para tanto intra-neuronal e antigénios de superfície são patogénicas 3, 5-9, 11. Assim, um procedimento que permite o estudo de anticorpo intracelular: interações proteína daria grande insight sobre a patogênese da doença. Os genes são comumente transfectado em células primárias e linhas de células em cultura, no entanto a transfecção de anticorpos em células tem sido dificultada pela alteração da estrutura do anticorpo ou a eficiência de transfecção fraca 12. Outros métodos de transfecção incluem a transfecção com base em anticorpo lipossomas catiónicos (consistindo de DOTAP / DOPE) e polyethylenimines (PEI), ambas das quais resultou numa diminuição de 10 vezes na transfecção de anticorpos em comparação com os controlos 12. O método realizado em nosso estudo é semelhante à de lípidos catiónicos mediadas métodos e utiliza um mecanismo de base de lípidos de modo a formar complexos não covalentes com os anticorpos através electrostática e hidrinteracções ophobic 13. Utilizamos Ab-deliverin reagente, que é uma formulação de lípidos capaz de capturar os anticorpos não covalentes através de interacções electrostáticas e hidrofóbicas e entregando-os no interior das células. Assim químico e genético acoplamentos não são necessários para a entrega de anticorpos funcionais em células vivas. Este método permitiu-nos realizar várias anticorpo rastreamento e localização de proteínas experiências, bem como as análises das conseqüências moleculares de anticorpo intracelular: interações proteína 9. Neste protocolo, será mostrado como os anticorpos para transfectar-se em neurónios rápida, reprodutível e com um grau elevado de eficiência de transfecção. Como exemplo, iremos utilizar anticorpos anti-hnRNP A1 e anti-IgG. Para a quantificação da eficácia de transfecção fácil o uso do anti-hnRNP anticorpos marcados com A1 Atto-550-NHS e marcado com FITC de IgG. Atto550 SNS é um novo rótulo com absorção molecular alta e yi quânticaeld. Fonte de excitação e filtros fluorescentes para Atto550 são semelhantes a Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Além disso, tem Atto550 fotoestabilidade elevada. Marcado com FITC de IgG foram utilizados como controlo para mostrar que este método é versátil e não dependente tingir. Esta abordagem e os dados que são gerados irão auxiliar na compreensão do papel que os anticorpos para antigénios alvo intracelulares podem desempenhar na patogénese de doenças humanas.

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Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Uma abordagem rápida para investigar as interacções e efeitos sobre os mecanismos moleculares relacionados com a presença de anticorpos em um ambiente intracelular é descrito. O método envolve a transfecção de anticorpos em células vivas utilizam uma formação complexo não-covalente com base em uma formulação de lípidos. A técnica é adaptável a linhas celulares imortalizadas, e células primárias.

Transfecção de anticorpos em neurônios como uma ferramenta para estudar a patogênese da doença

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Microdissecção Captura de Drosophila Neurônios periféricos

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Neurociência

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-loading: Uma ferramenta útil para examinar a extensão da Gap Coupling Tracer junção entre neurônios da retina

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Fosfato de cálcio transfecção de primário neurônios do hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Analyzer celular baseado em impedância Real-Time como uma ferramenta para delinear vias moleculares envolvidas na neurotoxicidade e neuroproteção em uma linha de células neuronais

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

O Sistema Olfativo como um modelo para estudar os padrões de crescimento axonal e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Injecções intramusculares Ao longo das placas Motor End: uma abordagem minimamente invasiva para Shuttle Tracers Diretamente em Neurônios Motores

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Stripe Ensaio para estudar a atividade atração ou repulsão de um substrato de proteína utilizando dissociado neurônios do hipocampo

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic fatias Hippocampal culturas como um modelo para estudo neuroproteção e invasão de células tumorais

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Administração exógena de agregados de microssomas associados alfa-synuclein para os neurônios primários como um modelo de célula poderosos de formação de fibrilas

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Baseada em célula de ensaio para estudar mediada por anticorpos Tau afastamento por Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...