Name: antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis
Uploaded: 2012-09-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis at JoVE.com

Detta arbete stöds av Office för forskning och utveckling, medicinsk forskning service, Department of Veterans Affairs. Denna studie har finansierats av en VA Merit recension Award (till MCL) och University of Tennessee Health Science Center Multiple Sclerosis Research Fund.

1. Antikroppsmärkning (figur 1) <ol><li> Gör 0,1 M NaHCO 3 buffert: <ul type="circle"><li> 8,4 g NaHCOs 3 </li><li> 29,2 g NaCl </li><li> 1 liter H-2 O </li></ul></li><li> Ta bufferten upp till ett pH av 8,4 med denna lösning (10,6 g Na 2 CO 3, 29,2 g NaCl, 1 liter H 2 0). </li><li> Lägg 35 il Atto550 NHS till 70 pl anti-hnRNPA1 och 500 pl NaHCOa 3 buffert och rotera under 1 timme vid rumstemperatur. Efter den timslånga rotation injicera...

<ol>
	<li>Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-specific+recognition+of+type+II+collagen+by+rheumatoid+arthritis+antibodies+is+shared+with+recognition+by+antibodies+that+are+arthritogenic+in+collagen-induced+arthritis+in+the+mouse.">Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse.</a> Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).</li><li>Chester, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lambert-Eaton+syndrome+antibodies:+reaction+with+membranes+from+a+small+cell+lung+cancer+xenograft.">Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft.</a> J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).</li><li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTLV-1+induced+molecular+mimicry+in+neurological+disease.">HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).</li><li>Reeves, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus.+Antibodies+to+DNA,+DNA-binding+proteins,+and+histones.">Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones.</a> Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).</li><li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+due+to+molecular+mimicry+as+a+cause+of+neurological+disease.">Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease.</a> Nat. Med. 8, 509-513 (2002).</li><li>Lee, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+that+recognize+functional+domains+of+hnRNPA1+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+neurological+disease.">Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease.</a> Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).</li><li>Kalume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mimicry:+cross-reactive+antibodies+from+patients+with+immune-mediated+neurologic+disease+inhibit+neuronal+firing.">Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing.</a> J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).</li><li>Levin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reactivity+between+immunodominant+human+T+lymphotropic+virus+type+I+tax+and+neurons:+implications+for+molecular+mimicry.">Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry.</a> J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).</li><li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potential+link+between+autoimmunity+and+neurodegeneration+in+immune-mediated+neurological+disease.">A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).</li><li>Smeenk, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies:+cause+of+disease+or+caused+by+disease.">Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease.</a> Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).</li><li>Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+glycosylation+of+target+proteins+implicate+molecular+mimicry+in+the+pathogenesis+of+HTLV-1+associated+neurological+disease.">Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease.</a> J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).</li><li>Reisinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+transfection+of+CHO+cells+with+chemically+defined+transfection+systems+and+investigation+of+their+potential+for+transient+and+stable+transfection.">Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection.</a> Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).</li><li>Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+intracellular+delivery+of+antibodies+into+live+cells.">Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells.</a> Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).</li><li>Radic, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+P2+is+an+autoantibody+target+in+mice+deficient+for+Mer,+Axl,+and+Tyro3+receptor+tyrosine+kinases.">Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases.</a> J. Immunol. 176, 68-74 (2006).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+'passive+transfer'+of+paraneoplastic+stiff+person+syndrome+with+antibodies+to+an+intracellular+antigen.">Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen.</a> Brain. 133, 3164-3165 (2010).</li><li>Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiff,+twitchy+or+wobbly:+are+GAD+antibodies+pathogenic.">Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic.</a> Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).</li><li>Magrys, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+anti-alpha-enolase+autoantibodies+in+pathogenicity+of+autoimmune-mediated+retinopathy.">The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy.</a> J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).</li><li>Geis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiff+person+syndrome-associated+autoantibodies+to+amphiphysin+mediate+reduced+GABAergic+inhibition.">Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition.</a> Brain. 133, 3166-3180 (2010).</li></ol>

För att testa hypoteser om specifika molekyler och deras uttryck, gener och andra vektorer som vanligen transfekteras in i celler. Den unika aspekten av detta förfarande är möjligheten att enkelt transfektera antikroppar i målceller. Vi utförde denna metod i fem separata experiment vardera i dubbletter. Transfektionseffektivitet resultat var liknande bland alla experiment. Viktigt, möjliggör metoden inträde av antikroppar i cellen utan att ändra antikroppar struktur eller funktion. Vidare, med användning av f...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Fluorescensmikroskop AxioObserver A1 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> AxioVision version 4,2 </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rhnRNPA1 </td><td> Abcam </td><td> Ab4791 </td></tr><tr><td> FITC märkt anti-Rigg </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> Atto550 NHS-ester </td><td> Sigma </td><td> 92.835 </td></tr><tr><td> Ab-DeliverIN </td><td> OZ Biosciences </td><td> AI20100 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 10% FBS +1% antibiotika </td><td> Gibco </td><td> 11320-033 </td></tr><tr><td> Poly-D-lysin 8-brunnars kultur objektglas </td><td> BD </td><td> 354.632 </td></tr><tr><td> Multi-Purpose Rotator </td><td> Vetenskaplig Industries Inc </td><td> Modell 151 </td></tr><tr><td> DAPI Montering Media </td><td> Millipore </td><td> S7113 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Ambion </td><td> 9626 </td></tr><tr><td> Dialysator </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 66.380 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0.5 </td><td> Millipore </td><td> UFC501096 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd (4% lösning) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Nano-släpp </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

antibody transfection into neurons as a tool to study disease pathogenesis

Antikroppar ger möjlighet att få nya insikter i olika evenemang som äger rum i levande system. Förmågan att producera mycket specifika antikroppar mot målproteiner har gjort för mycket precisa biologiska frågor som måste lösas. Viktigt har antikroppar implicerats i patogenesen av ett antal humana sjukdomar, inklusive systemisk lupus erythematosus (SLE), reumatoid artrit (RA), paraneoplastiska syndrom, multipel skleros (MS) och humant T-lymfotropt virus typ 1 (HTLV-1) tillhörande myelopati / tropiska spastisk parapares (HAM / TSP) 1-9. Hur antikroppar orsakar sjukdom är ett område med pågående utredning och data antyder att interaktionen mellan antikroppar och olika intracellulära molekyler resulterar i inflammation ändrade cellulära meddelanden och apoptos 10. Det har visat sig att patienter med MS och skinka / TSP producerar autoantikroppar mot intracellulära RNA-bindande protein heterogen ribonuclear protein A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Nya data tyder på att antikroppar mot både inom neuronala och ytantigener är patogena 3, 5-9, 11. Således ett förfarande som gör det möjligt att studera intracellulära antikropp: skulle proteininteraktioner låna stor insikt i sjukdomens patogenes. Gener vanligen transfekteras in i primära celler och cellinjer i kultur, har emellertid transfektion av antikroppar i celler har hindrats genom ändring av antikroppsstrukturen eller dålig transfektionseffektivitet 12. Andra metoder för transfektion innefattar antikroppar transfektion bygger på katjoniska liposomer (bestående av DOTAP / DOPE) och polyetyleniminer (PEI), som båda resulterade i en tio-faldig minskning i antikroppar transfektion jämfört med kontroller 12. Förfarandet utförs i vår studie liknar katjoniska lipid-medierade metoder och använder en lipid-baserad mekanism för att bilda icke-kovalenta komplex med antikropparna genom elektrostatisk och hydrophobic interaktioner 13. Vi utnyttjade Ab-DeliverIN reagens, vilket är en lipidberedning kan fånga antikroppar genom icke-kovalenta elektrostatiska och hydrofoba interaktioner och leverera dem inuti celler. Sålunda kemiska och genetiska kopplingar är inte nödvändiga för leverans av funktionella antikroppar i levande celler. Denna metod har gjort det möjligt för oss att utföra olika antikroppar spårning och experiment protein lokalisering, liksom analyser av molekylära konsekvenser intracellulär antikropp: proteininteraktioner 9. I detta protokoll kommer vi att visa hur man transfektera antikroppar i nervceller snabbt, reproducerbart och med en hög grad av transfektion effektivitet. Som exempel kommer vi att använda anti-hnRNP A1 och anti-IgG-antikroppar. För enkel kvantifiering av transfektionseffektiviteten vi använt anti-hnRNP A1 antikroppar märkta med Atto-550-NHS och FITC-märkt IgG. Atto550 NHS är en ny etikett med hög molekylär absorption och quantum yiELD. Excitationskälla och fluorescerande filter för Atto550 liknar Cy3 (Mos 556 Em. 578). Dessutom, har Atto550 hög fotostabilitet. FITC-märkt IgG användes som en kontroll för att visa att denna metod är mångsidig och inte färga beroende. Detta tillvägagångssätt och de data som genereras kommer att bidra till förståelsen av den roll som antikroppar mot intracellulära målantigener kan spela i patogenesen av sjukdomar hos människor.

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis at JoVE.com

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

En snabb metod för att undersöka interaktioner och effekter på molekylära mekanismer relaterade till närvaron av antikroppar i en intracellulär miljö beskrivs. Metoden innefattar transfektion av antikroppar till levande celler med användning av en icke-kovalent komplexbildning baserad på en lipidformulering. Tekniken är anpassningsbar till immortaliserade cellinjer och primära celler.

Antikropp Transfektion till neuroner som verktyg för att studera sjukdomens patogenes

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

Laser Capture Microdissection av Drosophila Neuron

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

Cut-loading: ett användbart verktyg för att undersöka omfattningen av Gap Junction Tracer kopplingen mellan näthinnan nervceller

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Kalciumfosfattransfektion av primär hippocampus nervceller

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Real-Time Impedans Baserade Cell Analyzer som verktyg att avgränsa Molecular involverade i neurotoxicitet och Neuroprotektion i en neuronal cellinje

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

Luktsystemet som en modell för att studera axonal tillväxt Mönster och morfologi<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Intramuskulär injektion Längs motoränden Plates: en minimalinvasiv metod för Shuttle Tracers Direkt i motoriska nervceller

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Rand analys för att studera Attraktiv eller frånstötande aktivitet av en proteinsubstrat Använda Dissocierad hippocampus nervceller

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

Organotypic Hippocampus Slice kulturer som en modell att studien neuroprotektion och invasivitet av tumörceller

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Exogena administrering av mikrosomer-associerade alfa-synuklein aggregat till primära nervceller som en kraftfull Cell modell av fibriller bildas

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

Cell-baserad analys att studera antikroppsmedierad Tau Clearance av mikroglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...