Name: quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00
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この作品は、ピッツバーグ財団と米国立衛生研究所（NIH）からの補助金によって支えられて[GM087798。CA148629。ES019498] RWSに。 UPCIレンチウイルス機能のサポートは、国立衛生研究所からがんセンター·サポート·グラント[P30 CA047904]でRWSに提供されました。サポートは、ピッツバーグ大学の薬理学教室＆DSのケミカルバイオロジーによって提供されました。サポートもCVにエストロゲンによって提供されました。

1。分子ビーコンのデザイン 1.1は、あなたの分子ビーコンの設計と発注あなたの分子ビーコンの設計では、次のことを考慮する必要があります。 <ol class="lalpha"><li>我々は43-merのDNAオリゴヌクレオチドとの良好な結果を持っています。 GC含量&gt; 32％であるべきである。 5 &#39;末端のGベースを除外します。 </li><li>リクエスト6-FAM（6 - カルボキシフルオレ...

<ol>
	<li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide.">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li><li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide.">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids.">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).</li><li>Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecularly+quenched+fluorogenic+substrates+for+hydrolytic+enzymes.">Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes.</a> Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).</li><li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O(+6)-methylguanine+DNA+methyltransferase,+methylpurine+DNA+glycosylase,+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities:+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase.">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li><li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons.">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li><li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon.">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li><li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time.">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase.">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li><li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity.">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li><li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity.">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li><li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells.">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li><li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon.">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li><li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells.">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li><li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities.">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li></ol>

ヘリカーゼ活性6を含む多数の分子や酵素活性を検出および定量のための用語&quot;分子ビーコン&#39;を使用して600の引用は、DNAポリメラーゼ活性7,8、DNAリガーゼ活性9、テロメラーゼ活性10、DNA光回復酵素活性を11とDNA /超えています他の多くの間RNAハイブリッド12。上記のDNA修復活性の測定のための分子ビーコンの使用に加えて、我々と他のBER活?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー</td><td> P217-500 </td><td>分子のグレード</td></tr><tr><td> EDTA </td><td>フィッシャー</td><td>とも結合-500 </td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー</td><td> BP229-1 </td><td>分子のグレード</td></tr><tr><td> DTT </td><td>フィッシャー</td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-ソリューション</td><td>インビトロジェン</td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-塩</td><td>シグマ</td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>シグマ</td><td> 17から8 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μMフィルター</tD&gt; <td>ナルゲン</td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td>スライド-A-Lyzer透析製品</td><td>ピアース</td><td> 66373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td>注射器</td><td>フィッシャー</td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td>針</td><td>フィッシャー</td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャー</td><td> 05-408-129 </td><td>ブラック</td></tr><tr><td> 15mlファルコンチューブ</td><td>フィッシャー</td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBus​​terタンパク質抽出キット</td><td>カルビオケム</td><td> 71183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td>分子ビーコン</td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioRadタンパク質アッセイ染料の再エージェントに集中</td><td> BioRad社</td><td>カタログ番号500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons

我々は塩基除去修復（BER）分子ビーコンを用いたDNAグリコシラーゼと細胞核溶解物中のAPエンドヌクレアーゼ活性の定量的、リアルタイム測定のための方法を説明します。基板（ビーコン）が6 - カルボキシフルオレセイン（6-FAM）5 &#39;末端およびオリゴヌクレオチドの3&#39;末端に結合しDABCYL部分に結合した部分を有する単一の基本病変を含むデオキシオリゴヌクレオチドで構成されています。 BER分子ビーコンは、長さ43塩基であるとシーケンスは、幹1,2のループで13個のヌクレオチド、15塩基対のステム-ループ構造の形成を促進するために設計されています。この構成では、折り畳まれたときに6-FAM部分はフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）3,4を介した非蛍光性の方法でDABCYLによってクエンチされています。病変は6-FAMの部分を含む残りの5つのベースオリゴヌクレオチドは、幹から放出されるように、次の基本病変の除去と鎖切断に配置されている。解放するDNA修復のレベルに比例する蛍光の増加にクエンチャー（DABCYL）の結果から数量剥離。蛍光値の読み込み複数集めることによって、BERの活動のリアルタイム評価が可能です。標準的な定量的リアルタイムPCR装置の使用は、多数のサンプルの同時分析を行うことができます。単一の基本病変、これらのBERの分子ビーコンのデザインは、運動解析、BERの定量化と阻害剤の検証に従順であり、組織や腫瘍細胞溶解物や精製されたタンパク質とDNA修復活性の定量化のための適応可能である。これらの分子ビーコンを使用して、腫瘍ライセートや組織の吸引のBER活動の分析は、機能的なバイオマーカーの測定にも適用可能である。また、この定量的なアッセイを用いて精製したタンパク質とBERの活動の分析は、BER阻害剤の発見と検証のための迅速、ハイスループットな方法を提供します。

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Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

我々は、細胞核溶解物中のDNAグリコシラーゼとAPエンドヌクレアーゼ活性の定量的、リアルタイム測定のための方法を説明します。アッセイは、動態解析に従順DNA修復活性の速度を得られる組織および腫瘍溶解液または精製したタンパク質とDNA修復活性の定量化のための適応可能である。

病変の特異的分子ビーコンを活用した細胞ライセート中の塩基除去修復活性の定量、リアルタイム分析

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

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