Name: a modified epa method 1623 that uses tangential flow hollow-fiber ultrafiltration and heat dissociation steps to detect waterborne cryptosporidium and giardia spp.
Uploaded: 2012-07-09T13:00:00
Duration: 12 min 11 s
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Nous tenons à remercier Ann Grimm et Michael Zimmerman, pour examen critique de ce manuscrit et Doug Hamilton pour son soutien technique.

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	<li>DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptosporidium+and+Giardia+recoveries+in+natural+waters+by+using+Environmental+Protection+Agency+Method+1623.">Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952 (2002).</li><li>Hill, V. R., Kahler, A. M., Jothikumar, N., Johnson, T. B., Hahn, D., Cromeans, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistate+evaluation+of+an+ultrafiltration-based+procedure+for+simultaneous+recovery+of+enteric+microbes+in+100-liter+tap+water+samples.">Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 4218-4225 (2007).</li><li>Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Hahn, D., Narayanan, J., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Amburgey, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+method+for+simultaneous+recovery+of+diverse+microbes+in+drinking+water+by+ultrafiltration+with+sodium+polyphosphate+and+surfactants.">Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 6878-6884 (2005).</li><li>Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. 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L&#39;Agence américaine de protection de l&#39;environnement à travers son Bureau de la recherche et le développement en collaboration avec l&#39;Office des eaux souterraines et le Centre de l&#39;eau potable d&#39;assistance technique financé la recherche décrite ici. Tous les travaux ont été soutenus sur le site de l&#39;EPA des États-Unis, Cincinnati, Ohio. Bien que les informations décrites dans cet article a été financé en tout ou en partie par l&#39;Agence américaine de protection de l&#39;environnement sous contrat (contrat EP-C-06-031) à Shaw de l&#39;environnement et de l&#39;Infrastructure, Inc, il ne reflète pas nécessairement les vues de la Agence et aucune approbation officielle doit être déduite. Il a été soumis à examen de l&#39;Agence et approuvé pour publication.

Tangentielle débit à fibres creuses d&#39;ultrafiltration est une technique alternative et efficace pour la concentration initiale des oocystes de Cryptosporidium et des kystes de Giardia dans l&#39;eau. Fibres creuses d&#39;ultrafiltration est moins cher que les filtres traditionnels. Depuis il a la capacité de se concentrer des oocystes de Cryptosporidium et des kystes de Giardia à partir d&#39;une variété de matrices d&#39;eau différents, il est une alternative utile aux techniques de filtration actuelles utilisées pour la méthode EPA 1623. Comme avec la plupart des autres méthodes de filtration, d&#39;ultrafiltration à fibres creuses est sujette à l&#39;encrassement des échantillons très turbides. Eau à haute pression qui découlerait de l&#39;encrassement du filtre, c&#39;est pourquoi il est recommandé de surveiller la pression pendant la course de filtration. En plus de oocystes de Cryptosporidium et des kystes de Giardia, fibres creuses d&#39;ultrafiltration a été montré qu&#39;il était capable de se concentrer les bactéries et les virus 1-3,5,8. Fibres creuses d&#39;ultrafiltration outlined dans cette méthode peut être utilisée pour concentrer des organismes multiples dans un seul échantillon. Il est à noter que l&#39;obtention d&#39;un volume final compris entre 200 et 250 ml est l&#39;étape finale critique dans la procédure de concentration, afin que les étapes de centrifugation supplémentaires, qui peuvent entraîner une perte de kyste (oo), sont évités (étape 2.2). Cependant, ce qui permet le volume dans la bouteille d&#39;abandonner trop faible peut avoir des effets défavorables sur les recouvrements car il ne sera pas un volume suffisant de liquide de forcer tous les oocystes ou des kystes dans la bouteille rétentat. Par conséquent, il est recommandé de maintenir un volume final compris entre 200 et 250 ml. La chaleur de dissociation est une alternative à l&#39;étape de dissociation acide dans la méthode 1623. Cette autre étape a été montré pour améliorer la récupération des oocystes de Cryptosporidium et de réduire la variation méthode lorsqu&#39;il est isolé de la rivière soit ou 9 eau à réactif. Une comparaison côte à côte de l&#39;acide et la chaleur de dissociation démontré que les méthodes utilisant la chaleur pour dissociationte les organismes des billes immunomagnétiques produit des recouvrements plus élevés pour les deux moyennes Cryptosporidium et Giardia. En outre, la précision des recouvrements Cryptosporidium et Giardia était meilleure dans les échantillons traités à la chaleur de dissociation par rapport à la dissociation acide 9. L&#39;incorporation de HFUF que l&#39;étape de concentration permet une plus grande souplesse en offrant la possibilité de se concentrer de multiples organismes. En outre, il est une alternative moins coûteuse à la méthode de filtration options actuelles de 1623.

<table border="1"><tbody><tr><td> Equipement / Réactif </td><td> Vendeur </td><td> Catalogue # </td></tr><tr><td> Asahi Kasei Rexeed 25 S / R humides à fibres creuses ultrafiltres </td><td> Composez médicale </td><td> REXEED25S / R </td></tr><tr><td> I / P 73 (Masterflex R-3603), ou équivalent </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06408-73 </td></tr><tr><td> L / S 24 (Masterflex platinum), ou équivalent </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-24 </td></tr><tr><td> L / S 15 (Masterflex platinum), ou équivalent </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-15 </td></tr><tr><td> L / S 36 (Masterflex platinum), ou équivalent </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-36 </td></tr><tr><td> I / P Entraînement Brushless de précision </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77410-10 </td></tr><tr><td> I / P Chef Facile pompe de charge </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77601-10 </td></tr><tr><td> Noir PEHD Tee, 1/4 &quot;x 3/8&quot; x 3/8 &quot; </td><td> Plastiques US </td><td> 62064 </td></tr><tr><td> Masterflex connecteur en T L / S 15-25 </td><td> Cole Parmer </td><td> Ex.-30613-12 </td></tr><tr><td> Nalgene lourde bouteille pp L 1 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06257-10 </td></tr><tr><td> 10 ml Pipettes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11C </td></tr><tr><td> Nalgene remplissage / purge bouchon pour 1/4 &quot;tube, 53B </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06258-10 </td></tr><tr><td> Manomètre </td><td> Cole Parmer </td><td> A-680-46-10 </td></tr><tr><td> Raccord droit, NPT (F), 1/4 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06469-18 </td></tr><tr><td> TNP branches de tés, pp naturelle </td><td> Cole Parmer </td><td> A-30610-75 </td></tr><tr><td> Attaches de pincement, 1/2 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06833-00 </td></tr><tr><td> Custom ajustement adaptateurs DIN </td><td> Moulé Products Corp </td><td> MPC-855NS.250 </td></tr><tr><td> Anneau support </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-670b </td></tr><tr><td> Pinces support annulaire </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-769-6Q </td></tr><tr><td> Keck rampe de serrage, 14mm </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06835-10 </td></tr><tr><td> Polyphosphate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 305553 </td></tr><tr><td> Thiosulfate de sodium pentahydraté </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72050 </td></tr><tr><td> Antimousse Y-30 émulsion </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5758 </td></tr><tr><td> Tween-80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> 10 L cubitainer pliable en polyéthylène haute densité </td><td> VWR </td><td> IR314-0025 </td></tr><tr><td> Centrifuger porte-bouteilles </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-663-103 </td></tr><tr><td> 250 ml tubes à centrifuger coniques </td><td> Corning </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> Entonnoir jetable </td><td> Cole Parmer </td><td> U 6122-10 </td></tr><tr><td> Pissette </td><td> Cole Parmer </td><td> U-06252-40 </td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td></tr><tr><td> Rotor swing-out </td><td> Beckman Coulter </td><td> ARIES SX4750 </td></tr><tr><td> Centrifuger adaptateurs baquets pour les tubes de 250 ml coniques </td><td> Beckman Coulter </td><td> 349849 </td></tr><tr><td> 200 ul de gros calibre des pointes de pipette </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-707-134 </td></tr><tr><td> VacuShield filtre </td><td> Gelman </td><td> 629-4402 </td></tr><tr><td> 5 pipettes ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-11D </td></tr><tr><td> Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia combo kit </td><td> JeDexx </td><td> 73002 </td></tr><tr><td> Tubes de 50 ml à centrifuger coniques </td><td> Faucon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Dynal L10 plats tubes face </td><td> IDEXX </td><td> 74003 </td></tr><tr><td> Minuteur </td><td> VWR </td><td> 23609-202 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-6 aimant </td><td> IDEXX </td><td> 12002D </td></tr><tr><td> 1 ml Pipettes </td><td> VWR </td><td> 53283-700 </td></tr><tr><td> 1,5 ml à faible adhérence microtubes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-320 </td></tr><tr><td> 1000 pipette ul &amp; conseils barrière correspondantes </td><td> Gilson </td><td> P1000/DF1000ST </td></tr><tr><td> 100 pipette ul &amp; conseils barrière correspondantes </td><td> Gilson </td><td> P100/DF100ST </td></tr><tr><td> 9 pouces pipettes Pasteur </td><td> VWR </td><td> 14672-412 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-S aimant </td><td> IDEXX</td><td> 12020D </td></tr><tr><td> Vortex </td><td> VWR </td><td> 14216-188 </td></tr><tr><td> Mélangeur rotateurs Dynabeads </td><td> IDEXX </td><td> 94701 </td></tr><tr><td> Bloc thermique </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718-2 </td></tr><tr><td> Perles Armure de laboratoire </td><td> Lab Armure </td><td> 42370-750 </td></tr><tr><td> Thermomètre digital </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-077-60 </td></tr><tr><td> Phosphate-tampon salin 1X pH 7,4 (PBS 1X) </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td></tr><tr><td> Diapositives seul endroit </td><td> IDEXX </td><td> 30201 </td></tr><tr><td> Couverture de verre </td><td> Corning </td><td> 287018 </td></tr><tr><td> EasyStain kit directe </td><td> BTF </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 pipette ul &amp; conseils barrière correspondantes </td><td> Gilson </td><td> P10 &amp; DF10ST </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6&#39;-Diamidino-2-phényl-indole dichlorhydrate (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td></tr><tr><td> Vernis à ongles </td><td> Fisher Scientific </td><td> S30697 </td></tr><tr><td> Le méthanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> L6815 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34155 </td></tr><tr><td> Incubateur </td><td> Boekel scientifique </td><td> 133000 </td></tr><tr><td> glisser plus chaud </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-474-521 </td></tr><tr><td> Huile à immersion, type A ND = 1,515 </td><td> Nikon </td><td> MXA20234 </td></tr><tr><td> Nikon 90i microscope avec des capacités de DIC </td><td> Nikon </td><td> MBA 77000 </td></tr><tr><td> Plan d&#39;APO objectif 100x </td><td> Nikon </td><td> MRD01901 </td></tr><tr><td> Planifiez Achro 20X </td><td> Nikon </td><td> MRL00202 </td></tr><tr><td> Filtre FITC </td><td> Nikon </td><td> 96302 </td></tr><tr><td> DAPI filtre </td><td> Nikon </td><td> 96301 </td></tr><tr><td> X-Cite illuminateur de fluorescence </td><td> Nikon </td><td> 87540 </td></tr><tr><td> Papier pour lentilles </td><td> Nikon </td><td> 76997 </td></tr><tr><td> Biohazard sac jetable </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01-829D </td></tr><tr><td> Biohazard récipient pour objets tranchants </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-827-117 </td></tr><tr><td> Peroxyde d&#39;hydrogène à 3% </td><td> VWR </td><td> BDH3540-2 </td></tr><tr><td> Javellisant </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1952030 </td></tr><tr><td> Wypall </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34790 </td></tr></tbody></table>

a modified epa method 1623 that uses tangential flow hollow-fiber ultrafiltration and heat dissociation steps to detect waterborne cryptosporidium and giardia spp.

Espèces Cryptosporidium et Giardia sont deux des plus répandus des protozoaires qui causent des épidémies d&#39;origine hydrique diarrhéiques dans le monde. Afin de mieux caractériser la prévalence de ces agents pathogènes, la méthode EPA 1623 a été élaboré et utilisé pour surveiller les niveaux de ces organismes dans l&#39;eau potable aux États-Unis fournit 12. Procédé comporte trois parties principales, la première est la concentration de l&#39;échantillon dans lequel au moins 10 litres d&#39;eau de surface brute est filtrée. Les organismes et les débris piégés sont ensuite élue du filtre et centrifugé pour concentrer davantage l&#39;échantillon. La deuxième partie de la méthode utilise une procédure de séparation immunomagnétique où l&#39;échantillon d&#39;eau concentrée est appliquée à des billes immunomagnétiques qui se lient spécifiquement aux oocystes de Cryptosporidium et des kystes de Giardia permettant l&#39;élimination spécifique des parasites des débris concentré. Ces kystes (oo) sont ensuite détachés des billes magnétiques par un procé dissociation acidecédure. La dernière partie de la méthode est la coloration par immunofluorescence et le dénombrement où (oo) kystes sont appliqués à une diapositive, taché, et énuméré par microscopie. Méthode 1623 a quatre cotés systèmes concentration de l&#39;échantillon pour capturer les oocystes de Cryptosporidium et des kystes de Giardia dans l&#39;eau: filtres Envirochek (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), les filtres Envirochek HT (Pall Corporation), les filtres Filta-Max (IDEXX, Westbrook, MA), ou centrifugation à flux continu (Haemonetics, Braintree, MA). Toutefois, le Cryptosporidium et Giardia recouvrements kystes et d&#39;oocystes) ont beaucoup varié en fonction de la matrice des sources d&#39;eau et les filtres utilisés 1,14. Un nouveau flux tangentiel à fibres creuses d&#39;ultrafiltration (HFUF) système a récemment été montré pour être plus efficace et plus robuste à la récupération des oocystes de Cryptosporidium et les kystes de Giardia à partir de matrices d&#39;eau différents, d&#39;ailleurs, il est moins coûteux que l&#39;option autre capsule de filtres et peut se concentrer de multiples pathogènes simultanément 1-3,5-8,10,11. En outre, des études antérieures par Hill et ses collègues ont démontré que le HFUF considérablement amélioré Cryptosporidium recouvrements des oocystes lors directement comparés avec les filtres HT Envirochek 4. D&#39;autres modifications aux méthodes actuelles ont également été signalés à améliorer les performances des méthodes. Remplacement de la procédure de dissociation acide avec la chaleur de dissociation a été montré pour être plus efficace pour séparer Cryptosporidium des billes magnétiques dans certaines matrices 9,13. Ce protocole décrit une méthode de modification de 1623 qui utilise le système de filtration HFUF nouvelle étape avec la chaleur de dissociation. L&#39;utilisation de HFUF avec cette méthode modifiée est une alternative moins chère à l&#39;APE actuels options Méthode de filtration 1623 et offre plus de souplesse en permettant la concentration des organismes multiples.

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A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Ce protocole décrit l&#39;utilisation d&#39;un flux de fibres creuses système d&#39;ultrafiltration tangentielle concentration de l&#39;échantillon et une dissociation de chaleur étapes alternatives pour la détection de aqueuse<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Et<em&gt; Giardia</em&gt; Espèces en utilisant la méthode EPA 1623.

Une méthode mise à jour EPA 1623 qui utilise tangentielle débit à fibres creuses d&#39;ultrafiltration et de chaleur étapes de dissociation pour la détection de voie d&#39;eau<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Et<em&gt; Giardia spp.</em

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