Name: an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice
Uploaded: 2012-08-17T13:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier Catherine Alford pour des suggestions sur les méthodes de dissociation cellulaire et Kevin Weller, David Flaherty et la Bretagne Matlock pour le soutien à la ressource partagée cytométrie en flux à la Vanderbilt University Medical Center et Melissa A. Musser d&#39;assistance artistique avec des illustrations. Nous remercions les Drs. Jack Mosher et Sean Morrison pour obtenir des conseils sur la mise en œuvre d&#39;isolement des progéniteurs neuronaux. Le flux de ressource partagée MVC cytométrie est pris en charge par le Centre du cancer Vanderbilt Ingram (P30 CA68485) et la Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404). Ce travail a été soutenu par un financement à partir de US National Institutes of Health des subventions DK064251, DK086594, et DK070219.

1. Préparation des médias (Toutes les étapes de fait dans la hotte de culture tissulaire) <ol><li> Mélanger le suivant: 44 L-15 ml de milieu, 0,5 ml 100X pénicilline / streptomycine (P / S), 0,5 ml à 100 mg / ml de sérumalbumine bovine (BSA), 0,5 ml de HEPES 1M, 5 ml de tissus de qualité de l&#39;eau de la culture. Assurez-vous de mélanger BSA et P / S avant d&#39;ajouter. Ce volume devrait être suffisant pour la dissociation d&#39;un maximum de cinq différents types de tissus. Ce support sera utilisé à l...

<ol>
	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

Lignes journaliste de souris exprimant journalistes fluorescentes sont de plus en largement disponibles grâce à des efforts multiples dans le milieu de la génétique murine 1,8,9. En conséquence, la méthode de la dissociation illustré ici peut être largement appliquée pour l&#39;isolement de sous-types neuronaux distincts basés sur les profils d&#39;expression des neurotransmetteurs ou des récepteurs de tissus fœtaux soit ou adulte. Alors que nous avons optimisé cette méthode basée sur l&#39;exp...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom réactif </td><td> Vendeur </td><td> Le numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Sigma (fab: Technologies des piles innovantes) </td><td> A7089-100ML </td><td> Conserver congelé en aliquots de 1 ml </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D-4527 </td><td> Congelés à -20 ° C à 5 mg / ml dans 1xHBSS, (Utilisé dans Quench, Quench 1:5) </td></tr><tr><td> 10X PBS pH 7,4 </td><td> Gibco </td><td> 70011-044 </td><td> Compléter à 1x avec de l&#39;eau de qualité culture tissulaire, puis filtre stérile </td></tr><tr><td> 10X HBSS w / o Ca ou Mg </td><td> Gibco </td><td> 14185-052 </td><td> Compléter à 1x avec de l&#39;eau de qualité culture tissulaire, puis filtre stérile </td></tr><tr><td> Leibovitz milieu L-15 </td><td> Gibco </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine 100X </td><td> Gibco </td><td>15140-133 </td><td> Magasin aliquotés à -20 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-100G </td><td> Stockez aliquotés à -20 ° C, 100 mg / ml dans de l&#39;eau </td></tr><tr><td> Biowhittaker 1M HEPES à 0,85% de NaCl </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 um NITEX Membrane Nylon Mesh </td><td> Sefar Amérique </td><td> 3-38/22 </td><td> Coupez-les en carrés ~ 3 cm. UV traiter toute la nuit pour stériliser dans la hotte de culture tissulaire. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 tubes en polystyrène ml </td><td> Faucon </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubes coniques </td><td> Corning </td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td> Beaux-Pince à dissection </td><td> Instruments belle science </td><td> 11251-30 </td><td> Dumont # 5 forcep, Dumoxel, la norme pointe 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> Dissection Spoon </td><td> Instruments belle science </td><td> 10370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

Au cours du développement de la crête neurale (NC) dérivés de progéniteurs neuronaux migrer loin du tube neural pour former ganglions autonomes dans les organes viscéraux comme l&#39;intestin et du tractus urinaire inférieur. Les deux cours du développement et dans les tissus matures ces cellules sont souvent très dispersés à travers les tissus de telle sorte que l&#39;isolement des populations discrètes en utilisant des méthodes comme la capture laser micro-dissection est difficile. Ils peuvent cependant être directement visualisée par l&#39;expression de journalistes fluorescentes chassés de régions régulatrices de gènes spécifiques des neurones comme la tyrosine hydroxylase (TH). Nous décrivons une méthode optimisée pour des rendements élevés de TH viable + de progéniteurs neuronaux à partir de tissus fœtaux de souris viscérales, y compris l&#39;intestin et inférieure du tractus urogénital (LUT), fondée sur la dissociation et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Le gène codant pour la Th enzyme limitante pour la production de catécholamines. Entériques progéniteurs neuronaux commencent à exprimer TH durIng leur migration dans l&#39;intestin du fœtus 1 et TH est également présent dans un sous-ensemble de neurones des ganglions pelviens adultes 2-4. La première apparition de cette lignée et la distribution de ces neurones dans d&#39;autres aspects de la LUT, et leur isolement n&#39;a pas été décrite. Progéniteurs neuronaux exprimant TH peut être facilement visualisées par l&#39;expression de l&#39;EGFP dans des souris porteuses du transgène construction Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Nous imagée expression de ce transgène dans des souris fœtales afin de documenter la distribution de TH + cellules dans la LUT développer à 15,5 coït jours après (DPC), désignant le matin de la détection prise de 0,5 jpc, et a observé que un sous-ensemble des progéniteurs neuronaux dans la coalescence pelvienne ganglions expresse EGFP. Pour isoler TH + LUT progéniteurs neuronaux, nous avons optimisé les méthodes qui ont été initialement utilisés pour purifier les cellules souches neurales de crête de l&#39;intestin de souris fœtale 2-6. Efforts antérieurs visant à isoler NC dérivés populations invoquésdigestion avec un cocktail de collagénase et de la trypsine pour obtenir des suspensions cellulaires pour la cytométrie en flux. Dans nos mains ces méthodes ont produit des suspensions cellulaires de la LUT avec la viabilité relativement faible. Compte tenu de l&#39;incidence déjà faible de progéniteurs neuronaux dans les tissus fœtaux LUT, nous avons décidé d&#39;optimiser les méthodes de dissociation de telle sorte que la survie des cellules dans les dissocie finales serait augmenté. Nous avons déterminé que douce dissociation dans Accumax (Cell Technologies innovantes, Inc), filtrage manuel, et le débit de tri à de faibles pressions nous ont permis d&#39;atteindre la survie constamment supérieur (&gt; 70% des cellules totales) avec des rendements ultérieurs de progéniteurs neuronaux suffisants pour l&#39;analyse en aval. La méthode que nous décrivons peut être largement appliquée à isoler une variété de populations neuronales foetales à partir soit ou adulte tissus murins.

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An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Une procédure optimisée pour purifier la crête neurale-dérivés progéniteurs neuronaux à partir de tissus fœtaux de souris est décrite. Cette méthode tire parti d&#39;expression parmi les allèles rapporteurs fluorescents d&#39;isoler des populations distinctes par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). La technique peut être appliquée pour isoler les sous-populations neuronales au cours du développement ou de tissus adultes.

Une procédure optimisée pour Fluorescence-activated tri cellulaire (FACS) Isolement du système nerveux autonome progéniteurs neuronaux de viscères de souris sur le fœtus

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Génération de cellules souches neurales à partir de tissus humains mis au rebut corticale fœtale

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