Name: an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice
Uploaded: 2012-08-17T13:00:00
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Die Autoren bedanken sich bei Catherine Alford für Anregungen Zelldissoziationslösung Methoden und Kevin Weller, David Flaherty und der Bretagne Matlock danken für die Unterstützung in der Durchflusszytometrie Shared Resource an der Vanderbilt University Medical Center und Melissa A. Musser für künstlerische Unterstützung mit Illustrationen. Wir danken Dr.. Jack Mosher und Sean Morrison Beratung beim Einsatz Isolierung von neuronalen Vorläuferzellen. Der VMC Durchflusszytometrie Shared Resource wird von der Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) und der Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404) unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus US-amerikanischen National Institutes of Health Zuschüsse DK064251, DK086594 und DK070219 unterstützt.

1. Vorbereitung der Medien (Alle Schritte in Gewebekultur Haube getan) <ol><li> Kombinieren der folgenden: 44 ml L-15 Medium, 0,5 ml 100X Penicillin / Streptomycin (P / S), 0,5 ml 100 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA), 0,5 ml 1 M HEPES, 5 ml Gewebekultur sterilem Wasser. Achten Sie darauf, BSA und P / S gründlich zu mischen, bevor Sie. Dieses Volumen sollte ausreichend sein für die Dissoziation von bis zu fünf verschiedenen Geweben Typen. Dieses Medium wird in Schritt 3.4 verwendet werden, um Abschrecken Lösungen f...

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	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

Maus-Reporter exprimieren fluoreszierenden Reporter sind eine immer stärkere Verbreitung über verschiedene Anstrengungen im murinen Genetik Gemeinde 1,8,9. Als ein Ergebnis die Dissoziation hier dargestellten Verfahren kann stark zur Isolierung von diskreten neuronalen Subtypen Neurotransmitter-Rezeptor oder Expressionsmuster von entweder fötalen oder adulten Geweben, aufgebracht werden. Während wir diese Methode auf Expression eines fluoreszierenden Reporter-Transgen Basis optimiert haben, kann es auch z...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz Namen </td><td> Verkäufer </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Sigma (MFR: Innovative Cell Technologies) </td><td> A7089-100ml </td><td> Bewahren eingefroren in 1 ml Aliquots </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D-4527 </td><td> Bei -20 ° C eingefroren 5 mg / ml in 1xHBSS, (Wird in Quench, Quench 1:5) </td></tr><tr><td> 10X PBS, pH 7,4 </td><td> Gibco </td><td> 70011-044 </td><td> Machen Sie bis zu 1x mit Gewebekulturqualität Wasser dann Sterilfilter </td></tr><tr><td> 10x HBSS w / o Ca-oder Mg </td><td> Gibco </td><td> 14185-052 </td><td> Machen Sie bis zu 1x mit Gewebekulturqualität Wasser dann Sterilfilter </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15-Medium </td><td> Gibco </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin 100X </td><td> Gibco </td><td>15140-133 </td><td> Lagerung bei -20 ° C aliquotiert </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-100G </td><td> -Store aliquotiert bei -20 ° C, 100 mg / ml in Wasser </td></tr><tr><td> Biowhittaker 1M HEPES in 0,85% NaCl </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 um NITEX Nylon-Mesh-Membran </td><td> Sefar America </td><td> 3-38/22 </td><td> Schneiden Sie in ca. 3 cm große Quadrate. UV-Behandlung über Nacht in der Gewebekultur Haube zu sterilisieren. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml Polystyrol-Röhrchen </td><td> Falke </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml konischen Röhrchen </td><td> Corning </td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td> Feine Dissektionszangen </td><td> Fine Science Instruments </td><td> 11251-30 </td><td> Dumont Nr. 5 forcep, Dumoxel, Standard-Spitze 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> Dissecting Löffel </td><td> Fine Science Instruments </td><td> 10370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

Bei der Entwicklung der Neuralleiste (NC)-abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen wandern weg von dem Neuralrohr zu autonomen Ganglien in inneren Organen wie dem Darm und der unteren Harnwege zu bilden. Sowohl während der Entwicklung und im reifen Gewebe Diese Zellen sind oft weit im gesamten Gewebe verteilt, so dass die Isolierung von diskreten Populationen mit Methoden wie Laser-Capture-Mikrodissektion ist schwierig. Sie können jedoch direkt visualisiert durch Expression von fluoreszierenden Reporter regulatorischen Regionen von Neuronen-spezifischen Gene, wie Tyrosin-Hydroxylase (TH) angetrieben wird. Wir beschreiben ein Verfahren, um hohe Ausbeuten von lebensfähigen TH + neuronalen Vorläuferzellen aus der fötalen Maus viszeralen Geweben, einschließlich Darm und unteren Urogenitaltrakts (LUT), bezogen auf Dissoziation und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) optimiert. Die Th-Gen kodiert für das geschwindigkeitsbestimmende Enzym für die Produktion von Katecholaminen. Magensaftresistente neuronalen Vorläuferzellen beginnen, während TH ausdrückenÝng ihrer Wanderung in der fetalen Darm 1 und TH ist auch in einer Untergruppe von Erwachsenen pelvinen Ganglien Neuronen 2-4. Der erste Auftritt dieser Linie und die Verteilung dieser Neuronen in anderen Aspekten der LUT und ihre Isolation ist nicht beschrieben worden. Neuronale Vorläuferzellen exprimiert TH kann leicht sichtbar gemacht durch die Expression von EGFP in Mäusen, die das Transgen-Konstrukt Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Wir abgebildet Ausdruck dieses Transgen in der fötalen Mäuse, die Verteilung der TH +-Zellen in den Entwicklungsländern LUT dokumentieren bei 15,5 Tage nach der Begattung (DPC), Benennung der Morgen des Plug-Erkennung als 0,5 DPC, und beobachtet, dass eine Teilmenge von neuronalen Vorläuferzellen in der Koaleszenz pelvinen Ganglien Express EGFP. Um LUT TH + neuronalen Vorläuferzellen zu isolieren, optimierte Methoden, die wir ursprünglich verwendet wurden, um Neuralleiste Stammzellen aus fetalem Mausdarm 2-6 zu reinigen. Vorherige Bemühungen zur NC-derived Populationen angeführten isolierenVerdau mit einem Cocktail von Collagenase, Trypsin, um Zellsuspensionen für die Durchflusszytometrie zu erhalten. In unseren Händen diesen Methoden hergestellten Zellsuspensionen aus der LUT mit relativ geringen Rentabilität. Angesichts der ohnehin schon niedrige Inzidenz von neuronalen Vorläuferzellen im fetalen Gewebe LUT, machten wir uns um die Dissoziation Verfahren, so dass das Überleben der Zelle in den letzten distanziert erhöht werden würde optimieren. Wir festgestellt, dass sanfte Dissoziation in Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), manuelle Filterung, Sortierung und Durchfluss bei niedrigem Druck konnten wir durchweg höhere Überlebensrate (&gt; 70% der gesamten Zellen) mit anschließender Ausbeuten von neuronalen Vorläuferzellen ausreichend für Downstream-Analyse zu erzielen. Verfahren beschreiben wir können allgemein angewendet werden, um eine Vielzahl von neuronalen Populationen von entweder fötalen oder adulten Mausgeweben isolieren.

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An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Ein optimiertes Verfahren zur Neuralleiste abgeleitet neuronalen Vorläuferzellen-aus fetalen Gewebe der Maus zu reinigen, wird beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile der Ausdruck von fluoreszierenden Reporter-Allele zu diskreten Populationen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) zu isolieren. Die Technik kann angewendet, um neuronale Subpopulationen während der Entwicklung oder von adulten Geweben zu isolieren.

Eine optimierte Methode für Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) Isolierung von Autonomic neuralen Vorläuferzellen aus inneren Organen des Fötus Mäuse

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Forschung

Neurowissenschaften

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) und Genexpressionsanalyse von Fos-exprimierenden Neurone von Frische und Gefrorene Rattenhirngewebe

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primärzellkultur von gereinigten Gurified GABAergic oder Glutamatergic Neuronen, die durch Fluoreszon-Sortierung gegründet wurden

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...