Name: an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice
Uploaded: 2012-08-17T13:00:00
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저자는 그림과 예술적인 도움 밴더빌트 대학 메디컬 센터와 멜리사 A. Musser에서 유동세포계측법 공유 자원의 지원을 세포 분리 방법과 케빈 Weller, 데이빗 레어 티 및 브르타뉴 맷락요에 대한 제안 캐서린 Alford 감사드립니다. 우리는 Drs 감사드립니다. 의 연결을 progenitors의 절연을 구현에 대한 조언 잭 Mosher와 숀 모리슨. VMC 유동세포계측법 공유 리소스는 밴더빌트 Ingram 암 센터 (P30 CA68485)와 밴더빌트 소화기 질환 연구 센터 (P30 DK058404)에 의해 지원됩니다. 이 작품은 건강 보조금 DK064251, DK086594 및 DK070219의 미국 국립 연구소의 자금 지원에 의해 지원되었다.

1. 미디어의 작성 (모든 단계는 조직 문화 후드에서 수행) <ol><li> 다음을 결합 : 44 ML의 L-15 중간, 0.5 ML 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S), 0.5 ML 100 밀리그램 / ML 소 혈청 알부민 (BSA), 0.5 ML 1M HEPES, 5 ML 조직 문화 학년 워터. 추가하기 전에 철저히 BSA 및 P / S를 섞어주십시오. 이 볼륨은 최대의 분리를위한 다섯 가지 조직 유형에 적합해야합니다. 이 미디어는 조직의 효소 분해 후 사용하기 위해 담?...

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	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

형광 기자를 표출 마우스 기자 라인 murine 유전학 사회 1,8,9의 여러 노력으로 널리 사용되고있다. 따라서 여기에 그림과 분리 방법은 널리 태아 또는 성인 조직 중의 신경 전달 물질이나 수용체 발현 패턴을 바탕으로 이산의 연결을 subtypes의 고립을 위해 적용할 수 있습니다. 우리가 형광등 transgene 기자의 표현을 바탕으로이 방법을 최적화하고 있지만, 그것은 또한 라이브 셀 immuno-라벨링 ?...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 이름 </td><td> 공급 업체 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> 시그마 (mfr : 혁신적인 휴대 기술) </td><td> A7089-100ML </td><td> 한 ML의 aliquots에 냉동 보관 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 시그마 </td><td> D-4527 </td><td> 저장된 -20에서 냉동 ° 1xHBSS의 C 5 밀리그램 / ML, (끄다에서 사용 1시 5분를 끄지) </td></tr><tr><td> 10X PBS의 산도 7.4 </td><td> Gibco </td><td> 70011-044 </td><td> 그리고 살균 필터는 조직 문화 등급 물로 1X까지 확인 </td></tr><tr><td> 10X HBSS W / O 칼슘이나 MG </td><td> Gibco </td><td> 14185-052 </td><td> 그리고 살균 필터는 조직 문화 등급 물로 1X까지 확인 </td></tr><tr><td> Leibovitz의 L-15 배지 </td><td> Gibco </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> 100X 페니실린은 / 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td>15140-133 </td><td> 저장소가 -20 ° C에서 aliquoted </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 </td><td> A3912-100G </td><td> -20 ° C, 물 100 밀리그램 / ML에 aliquoted 저장 </td></tr><tr><td> Biowhittaker 1M은 0.85 % NaCl에 HEPES </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 μm의 NITEX 나일론 메쉬 막 </td><td> Sefar 미국 </td><td> 3-38/22 </td><td> ~ 3cm의 사각형으로 잘라. 자외선은 조직 문화 후드에서 멸균을 위해 하룻밤 사이에 치료. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 MG / ML </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ML의 폴리스티렌 튜브 </td><td> 매 </td><td> 352,058 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ML 원뿔 튜브 </td><td> 코닝 </td><td> 430,790 </td><td></td></tr><tr><td> 파인 분석 해 봅시다 집게 </td><td> 파인 과학 계측기 </td><td> 11251-30 </td><td> 뒤몽 # 5 Forcep, Dumoxel, 표준 팁 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> 숟가락을 해부 </td><td> 파인 과학 계측기 </td><td> 10370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

개발에 신경 능선 (NC) 중 - 파생의 연결을 progenitors은 소장 및 하부 요로 같은 내장 기관의 자율 신경 구를 형성하는 신경 관에서 떨어져 마이 그 레이션. 레이저 캡처 마이크로 절개와 같은 방법을 사용하여 이산 인구의 분리가 어려운 있도록 개발 중에 성숙한 조직에서이 두 세포는 종종 광범위하게 조직 전체에 분산됩니다. 그들은 그러나 티로신 hydroxylase (TH)와 같은 신경 세포에 특정한 유전자의 규제 영역에서 구동 형광등 기자의 표현에 의해 직접적으로 시각이 될 수 있습니다. 우리는 가능한 TH 높은 수율 + 소장하고 분리와 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS)를 기반으로 더 낮은 urogenital 요로 (LUT)을 포함하여 태아의 마우스를 내장 조직에서 progenitors의 연결을 위해 최적화된 방법을 설명합니다. 번째 유전자는 catecholamines의 생산을위한 속도 - 제한 효소를 인코딩합니다. 장용의 연결을 progenitors는 TH 두어을 표현하기 시작태아 소장 1과 TH들의 이주를 접근한 것은 또한 성인 골반 신경의 뉴런 2-4 집합에 속해 있습니다. 이 혈통 이러한 LUT의 다른 측면에서 뉴런, 그들의 고립 배포의 첫 번째 모습이 설명되지 않았습니다. TH 표현의 연결을 progenitors은 transgene 구조 TG (TH-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1 나르는 생쥐에서 EGFP 표현하여 쉽게 시각이 될 수 있습니다. 우리는 0.5 dpc으로 플러그 검출의 아침을 지정, 15.5 일 게시물 성교 (dpc)에서 개발 LUT에서 TH의 배포판 + 세포를 문서화하는 태아 생쥐에서 transgene 표현 몇 군데, 그리고 관찰 그 coalescing에의 연결을 progenitors의 부분 집합 골반 신경 표현 EGFP. LUT TH +의 연결을 progenitors를 분리하기 위해, 우리는 초기에 태아의 마우스 소장 2-6에서 신경 능선의 줄기 세포를 정화하는 데 사용된 방법을 최적화. 이정표로 삼았죠 NC-파생 인구를 분리하기 위해 이전의 노력유동세포계측법위한 세포 현탁액을 얻을 수 collagenase와 트립신의 칵테일과 소화. 우리 손에 이러한 방법은 상대적으로 낮은 생존과 LUT에서 세포 현탁액을 생산했다. 태아 LUT 조직에의 연결을 progenitors의 이미 낮은 발병률을 감안할 때, 우리는 최종 dissociates의 세포 생존을 증가된다는 등의 분리 방법을 최적화하기 위해 밖으로 설정합니다. 우리는이 스트림 분석을위한 충분한의 연결을 progenitors의 후속 수율과 함께 지속적으로 더 큰 생존 (총 세포의&gt; 70 %) 달성 허용 낮은 압력에서 정렬을 그 잔잔한 Accumax의 분리 (혁신적인 휴대 기술, INC), 수동 필터링 및 흐름을 결정. 우리가 설명하는 방법은 크게 태아 또는 성인 murine 조직 중 하나의 연결에서 인구의 다양한 분리 적용할 수 있습니다.

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An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

태아 마우스 조직에서 신경 능선 - 파생의 연결을 progenitors 정화 최적화된 절차를 설명합니다. 이 방법은 형광 활성화된 셀 정렬 (FACS)에 의해 이산 인구를 분리하기 위해 형광등 기자 대립 유전자로부터 표현의 활용합니다. 기술은 개발 전반에 걸쳐 또는 성인 조직에서 subpopulations의 연결을 분리하여 적용할 수 있습니다.

태아 쥐의 내장 장기에서 자율 신경 Progenitors의 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) 절연을위한 최적화된 절차

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

연구

신경과학

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

쥐과 장내 신경 전구 세포에 대한 양이 세포 이동의 분석

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

셀 성인 마우스 뇌실 영역에서 신경 줄기 및 전구 세포의 정렬과 세포주기 역학의 라이브 이미징

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)와 신선한 및 냉동 쥐 뇌 조직 FOS를 발현하는 신경 세포의 유전자 발현 분석

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

형광 활성 세포 선별을 통해 확립 된 정제 GABAergic 또는 Glutamatergic 뉴런의 일차 세포 배양

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Dissection of Pelvic Autonomic Ganglia and Associated Nerves in Male and Female Rats

The bilateral major pelvic ganglia (MPG; synonym, pelvic ganglia) are the primary source of postganglionic sympathetic and parasympathetic neurons ...