Name: an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice
Uploaded: 2012-08-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Catherine Alford for forslag på celle dissosiasjon metoder og Kevin Weller, David Flaherty og Brittany Matlock for støtte i flowcytometrisystemer delt ressurs ved Vanderbilt University Medical Center og Melissa A. Musser for kunstnerisk hjelp med illustrasjoner. Vi takker legene. Jack Mosher og Sean Morrison for å få råd om å gjennomføre isolering av nevrale stamceller. VMC flowcytometrisystemer delt ressurs er støttet av Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) og Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404). Dette arbeidet ble støttet av midler fra US National Institutes of Health tilskudd DK064251, DK086594, og DK070219.

1. Utarbeidelse av Media (Alle trinn gjøres i vevskultur hette) <ol><li> Kombiner følgende: 44 ml L-15 Medium, 0,5 ml 100X Penicillin / Streptomycin (P / S), 0,5 ml 100 mg / ml Bovine serum albumin (BSA), 0,5 ml 1M HEPES, 5 ml Tissue Culture gradert vann. Pass på å blande BSA og P / S grundig før du legger. Dette volumet bør være tilstrekkelig for dissosiasjon av opptil fem ulike vev typer. Dette medier vil bli brukt i trinn 3.4 for å forberede slukke løsninger for bruk etter enzymatisk dissosiasjon av vev. <...

<ol>
	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

Mus reporter linjer uttrykker fluorescerende reportere blir allment tilgjengelig gjennom flere innsats i murine genetikk samfunnet 1,8,9. Som et resultat av dissosiasjon metoden illustrert her kan bli mye brukt for isolering av diskrete nevrale undertyper basert på nevrotransmitteren eller reseptor uttrykk mønstre fra enten føtale eller voksen vev. Mens vi har optimalisert denne metoden basert på uttrykk av et fluorescerende transgenet reporter, kan det også brukes til prøver uttrykker reseptorer på ce...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens Navn </td><td> Selger </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Sigma (MFR: Innovative Cell Technologies) </td><td> A7089-100ML </td><td> Oppbevar frosset i 1 ml alikvoter </td></tr><tr><td> DNase jeg </td><td> Sigma </td><td> D-4527 </td><td> Oppbevares fryst ved -20 ° C 5 mg / ml i 1xHBSS, (Brukes i quench, Quench 01:05) </td></tr><tr><td> 10X PBS pH 7,4 </td><td> Gibco </td><td> 70011-044 </td><td> Fyll opp til 1x med vevskultur karakter vann og sterilt filter </td></tr><tr><td> 10X HBSS w / o Ca eller Mg </td><td> Gibco </td><td> 14185-052 </td><td> Fyll opp til 1x med vevskultur karakter vann og sterilt filter </td></tr><tr><td> Leibovitz har L-15 medium </td><td> Gibco </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin 100X </td><td> Gibco </td><td>15140-133 </td><td> Oppbevares alikvoteres ved -20 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-100G </td><td> Oppbevar alikvoteres ved -20 ° C, 100 mg / ml i vann </td></tr><tr><td> Biowhittaker 1M HEPES i 0,85% NaCl </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 mikrometer NITEX Nylon Mesh Membrane </td><td> Sefar Amerika </td><td> 3-38/22 </td><td> Skjær i ca 3 cm firkanter. UV behandle over natten å sterilisere i vevskultur panseret. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml isopor rør </td><td> Falcon </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml koniske rør </td><td> Corning </td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td> Fin dissekere tang </td><td> Fin Science Instrumenter </td><td> 11251-30 </td><td> Dumont # 5 forcep, Dumoxel, standard tips 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> Dissekere Spoon </td><td> Fin Science Instrumenter </td><td> 10370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

Under utviklingen neural crest (NC)-deriverte nevrale stamceller vandrer bort fra nevralrøret å danne autonome ganglier i viscerale organer som tarm og nedre urinveier. Både under utvikling og i modne vev disse cellene er ofte spredt over hele vev slik at isolering av separate populasjoner med metoder som laser capture mikro-disseksjon er vanskelig. De kan imidlertid være direkte visualisert ved uttrykk av fluorescerende reportere fordrevet fra regulatoriske regioner av nervecellen-spesifikke gener som Tyrosin hydroksylase (TH). Vi beskriver en metode optimalisert for høye avlinger av levedyktige TH + nevrale stamceller fra foster mus viscerale vev, inkludert tarmen og nedre urogenitaltractus (LUT), basert på dissosiasjon og fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). Den Th genet koder hastighetsbegrensende enzym for produksjon av katekolaminer. Enteriske nevrale stamceller begynne å uttrykke TH durbehørig migrasjon i fosterstilling tarmen 1 og TH er også tilstede i en undergruppe av voksne bekken ganglia nerveceller 2-4. Den første opptreden i denne avstamning og fordelingen av disse nevronene i andre deler av LUT, og deres isolasjon har ikke blitt beskrevet. Nevrale stamceller uttrykker TH kan være lett visualiseres ved uttrykk av EGFP i mus som bærer transgene konstruktet Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc en. Vi avbildes uttrykk for dette transgenet i fosterets mus å dokumentere fordelingen av TH + celler i å utvikle LUT på 15,5 dager etter samleie (DPC), utpeking morgenen av plug påvisning som 0,5 DPC, og observert at en undergruppe av nevrale stamceller i fortetting bekken ganglier ekspress EGFP. For å isolere LUT TH + nevrale stamceller, optimalisert vi metoder som opprinnelig ble brukt til å rense neural crest stamceller fra foster mus tarmen 2-6. Tidligere forsøk på å isolere NC-deriverte populasjoner meget pålitelig ifordøyelse med en cocktail av collagenase og trypsin å få cellesuspensjoner for flowcytometri. I våre hender disse metodene produsert cellesuspensjoner fra LUT med relativt lav levedyktighet. Gitt den allerede lave forekomsten av nevrale stamceller i fosterlivet LUT vev, setter vi ut for å optimalisere dissosiasjon metoder slik at celle overlevelse i de endelige dissosierer skulle økes. Vi fastslått at milde dissosiasjon i Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), manuell filtrering, og flyt kildesortering lavtrykkene tillot oss å oppnå gjennomgående større overlevelse (&gt; 70% av totalt antall celler) med påfølgende avkastning av nevrale stamceller tilstrekkelige for nedstrøms analyse. Metoden beskriver vi kan grovt brukes for å isolere en rekke nevronale populasjoner fra enten føtale eller voksen murine vev.

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice at JoVE.com

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

En optimalisert prosedyre å rense neural crest-avledet nevrale stamceller fra foster mus vev er beskrevet. Denne metoden tar nytte av uttrykk fra fluorescerende reporter alleler å isolere diskrete populasjoner av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). Teknikken kan brukes til å isolere nevrale subpopulasjoner gjennom utvikling eller fra voksne vev.

En Optimalisert Prosedyre for fluorescens-aktivert Cell Sorting (FACS) Isolering av Autonome Neural stamfedre fra Visceral organer Fetal Mus

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering og kultur neural crest Celler fra Embryonic murin Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

En kvantitativ Cell Migration analysen for Murine resistente Neural stamceller

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, to kulturer: Isolation and Culture of Adult nevrale stamceller fra de to nevrogene Soner Individuell Mus

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Bruke fluorescensaktivert Cell Sorting å undersøke Cell-Type-Specific genuttrykk i Rat hjernevev

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Cell Sortering av Neural stilk og stamceller fra Adult Mouse subventricular Zone og Live-avbildning av deres Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sortering (FACS) og Gene Expression Analyse av Fos-uttrykker Nerveceller fra fersk og fryst Rat hjernevev

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Isolasjon og dyrking av nevrale Progenitors etterfulgt av Chromatin-Immunoprecipitation av Histone 3 lysin 79 Dimethylation

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primær Cell kultur renset GABAergic eller Glutamatergic neurons etablert gjennom fluorescens-aktivert Cell sortering

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...