Name: an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice
Uploaded: 2012-08-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Екатерину за Alford предложения по клеточная диссоциация методы и Кевин Уэллер, Дэвид Флаэрти и Бретани Мэтлок за поддержку в проточной цитометрии общих ресурсов в Университете Вандербильта медицинский центр и Мелисса А. Musser художественного помощь с иллюстрациями. Мы благодарим доктора. Джек Мошер и Шон Моррисон совета по реализации изоляции нейронов прародителей. VMC проточной цитометрии общих ресурсов поддерживается Вандербильта Ingram Cancer Center (P30 CA68485) и пищеварительной Вандербильта болезни Научно-исследовательский центр (P30 DK058404). Эта работа была поддержана финансирование от американского Национального института здравоохранения грантов DK064251, DK086594 и DK070219.

1. Подготовка Media (все шаги сделал в ткани капот культуры) <ol><li> Смешайте следующие: 44 мл L-15 средняя, ​​0,5 мл 100X пенициллина / стрептомицина (P / S), 0,5 мл 100 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 0,5 мл 1М HEPES, 5 мл культуры ткани класса воде. Будьте уверены, чтобы смешивать BSA и P / S тщательно...

<ol>
	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

Мышь репортер линии, экспрессирующие флуоресцентные журналистам становятся доступными через многочисленные усилия в мышиной генетики сообщество 1,8,9. В результате метод диссоциации показано здесь может широко применяться для изоляции дискретных нейронов подтипы на основе мед?...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> Реагент Имя </td><td> Продавец </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Sigma (МВС: Инновационные технологии Cell) </td><td> A7089-100мл </td><td> Хранить замороженные в 1 мл аликвоты </td></tr><tr><td> ДНКазы I </td><td> Сигма </td><td> D-4527 </td><td> Хранят в замороженном виде при температуре -20 ° C 5 мг / мл в 1xHBSS, (Используется в Quench, угашайте 1:5) </td></tr><tr><td> 10X рН 7,4 PBS </td><td> Гибко </td><td> 70011-044 </td><td> Сделать до 1x с водой ткань класса культуры, то стерильный фильтр </td></tr><tr><td> 10X HBSS без Ca или Mg </td><td> Гибко </td><td> 14185-052 </td><td> Сделать до 1x с водой ткань класса культуры, то стерильный фильтр </td></tr><tr><td> L-15 Лейбовиц в среду </td><td> Гибко </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> Пенициллина / стрептомицина 100X </td><td> Гибко </td><td>15140-133 </td><td> Магазин аликвоты при -20 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Сигма </td><td> A3912-100G </td><td> Хранить аликвоты при -20 ° С, 100 мг / мл в воде </td></tr><tr><td> Biowhittaker 1M HEPES в 0,85% NaCl </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 мкм NITEX нейлона Mesh мембранные </td><td> SEFAR Америки </td><td> 3-38/22 </td><td> Нарезать ~ 3 см площади. УФ лечить быстро, чтобы стерилизовать в капюшоне культуре ткани. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 мг / мл </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 мл труб из полистирола </td><td> Сокол </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> 15 мл конические пробирки </td><td> Гранулирование </td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td> Изобразительное диссекционные </td><td> Изобразительное инструменты науки </td><td> 11251-30 </td><td> Дюмон # 5 Forcep, Dumoxel, стандартный наконечник 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> Анатомический ложка </td><td> Изобразительное инструменты науки </td><td> 10370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the intestine and lower urinary tract. Both during development and in mature tissues these cells are often widely dispersed throughout tissues so that isolation of discrete populations using methods like laser capture micro-dissection is difficult. They can however be directly visualized by expression of fluorescent reporters driven from regulatory regions of neuron-specific genes like Tyrosine hydroxylase (TH). We describe a method optimized for high yields of viable TH+ neuronal progenitors from fetal mouse visceral tissues, including intestine and lower urogenital tract (LUT), based on dissociation and fluorescence-activated cell sorting (FACS). 
The Th gene encodes the rate-limiting enzyme for production of catecholamines. Enteric neuronal progenitors begin to express TH during their migration in the fetal intestine1 and TH is also present in a subset of adult pelvic ganglia neurons2-4 . The first appearance of this lineage and the distribution of these neurons in other aspects of the LUT, and their isolation has not been described. Neuronal progenitors expressing TH can be readily visualized by expression of EGFP in mice carrying the transgene construct Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mmnc1. We imaged expression of this transgene in fetal mice to document the distribution of TH+ cells in the developing LUT at 15.5 days post coitus (dpc), designating the morning of plug detection as 0.5 dpc, and observed that a subset of neuronal progenitors in the coalescing pelvic ganglia express EGFP. 
To isolate LUT TH+ neuronal progenitors, we optimized methods that were initially used to purify neural crest stem cells from fetal mouse intestine2-6. Prior efforts to isolate NC-derived populations relied upon digestion with a cocktail of collagenase and trypsin to obtain cell suspensions for flow cytometry. In our hands these methods produced cell suspensions from the LUT with relatively low viability. Given the already low incidence of neuronal progenitors in fetal LUT tissues, we set out to optimize dissociation methods such that cell survival in the final dissociates would be increased. We determined that gentle dissociation in Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), manual filtering, and flow sorting at low pressures allowed us to achieve consistently greater survival (&gt;70% of total cells) with subsequent yields of neuronal progenitors sufficient for downstream analysis. The method we describe can be broadly applied to isolate a variety of neuronal populations from either fetal or adult murine tissues.

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice at JoVE.com

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Оптимизированные процедуры для очищения нервного гребня, полученные от предшественников нейронов фетальных тканей мыши описано. Этот метод использует выражение из флуоресцентного аллелей репортер, чтобы изолировать отдельные группы по флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS). Этот метод может применяться для изоляции нейронов субпопуляции на протяжении всего развития или из взрослых тканей.

Оптимизирована процедура для флуоресцентной активированного сортировки клеток (FACS) Выделение вегетативной нервной прародителей из висцеральных органов плода мышей

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-колония Формирование анализа клеточной: Пробирной различать Добросовестный нервные стволовые клетки из нервных клеток-предшественников

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Генерация нервные стволовые клетки из эмбриона человека Выкинуть корковой ткани

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Количественный Анализ сотового мигрантах мышиных кишечных нейронных прародителей

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Один мышь, двух культур: Выделение и культивирование взрослых нервных стволовых клеток из двух Нейрогенные зон отдельных мышей

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Сотовый Сортировка нейронных стволовых и прогениторных клеток из взрослых мышей субвентрикулярной зоны и Live-визуализация клеточного цикла динамика

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Флуоресценция Активированный сортировки клеток (FACS) и экспрессии генов Анализ Fos-экспрессирующих Нейроны из свежих и замороженных крыс ткани головного мозга

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Изоляция и культивирование нервных прародителей, следуют иммунопреципитации Chromatin гистона 3 лизина 79 Dimethylation марки

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Первичная культура клеток очищенных ГАМК или глутамергических нейронов, созданных с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...