Name: purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain
Uploaded: 2012-08-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain at JoVE.com

De auteurs willen graag Dr Hui Zheng (Baylor College of Medicine) bedanken voor de APP cDNA. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie ​​R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), de John Sealy Memorial Endowment Fonds voor biomedisch onderzoek (AFO), en de Jean C. en William D. Willis Neuroscience Research Endowment (ESS). JMB is een geleerde in de Translationeel Onderzoek Scholar Program en een lid van de Universiteit van Texas Medical Branch Claude E. Pepper Oudere Amerikanen Independence Center (ondersteund door NIH subsidies UL1RR029876 en P30-AG-024832, respectievelijk).

<html> 1. Expressie van recombinant APP intracellulaire domein (AICD) <ol><li> Transform E. coli-stam BL21 met menselijke AICD (resten 649 tot 695 van APP, neuronale isovorm nummering) gekloneerd in vector pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Deze vector uitdrukkelijke AICD het C-terminale deel van een fusie-eiwit van glutathion-S-transferase (GST). Deze vector codeert ook trombine splitsingssequentie om loskomen van de GST eenheid. Details van het klonen AICD in pGEX-4T-1 kan worden gevonden in onze vorige publicatie <...

<ol>
	<li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretases:+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease.">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li><li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein.">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li><li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FE65+proteins+and+Alzheimer's+disease.">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li><li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein.">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li><li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR.">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li><li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors.">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li><li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2.">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li><li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis.">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li><li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor.">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li><li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content.">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li><li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation.">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866 (2010).</li><li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue.">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li><li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein.">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li><li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA.">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li><li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-simultaneous+imaging/pulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy.">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).</li><li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain.">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li><li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1,+a+lipid+raft+protein.">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk.">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li><li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport,+amyloid+precursor+protein,+kinesin-1,+and+the+processing+apparatus:+revisited.">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li><li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase.">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li><li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+under+the+atomic+force+microscope.">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li></ol>

In dit protocol hebben we geschetst van een procedure voor het verkrijgen van zeer zuivere AICD om structurele, biofysische en biochemische analyses. Deze procedure vereist geen geavanceerde chromatografie apparatuur en is daarom toegankelijk voor de meeste laboratoria. Andere groepen hebben gezuiverd AICD 5-7,16, met inbegrip van GST-AICD 17-19, voor de biochemische / structurele analyses. Nadelen naar de vorige protocollen zijn: een slechte oplosbaarheid van AICD 16, minder dan ideaal ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> Trombine </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilline </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> Bradford eiwittest reagens </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Coomassie blauw </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> Glutathion-agarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> p-aminobenzamidine-agarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> Volledige protease inhibitor cocktail </td><td> Roche </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer dialyse cassettes </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td> Chromatografiekolommen </td><td> Evergreen Wetenschappelijke </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> Emulgator </td><td> Avestin, Inc </td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td> Zeer aan te bevelen </td></tr><tr><td> Eppendorf Thermomixer </td><td> Eppendorf </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> Mica schijven </td><td> Ted Pella </td><td> 50 tot 12 </td><td></td></tr><tr><td> AFM uitkragingen </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM software </td><td> Nanotec </td><td> N / A </td><td> Free downloaden </td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

Amyloïde voorlopereiwit (APP) is een type I transmembraan eiwit geassocieerd met de pathogenese van de ziekte van Alzheimer (AD). APP wordt gekenmerkt door een groot extracellulair domein en een korte cytosolische domein zogenaamde APP intracellulaire domein (AICD). Tijdens rijping door de secretieroute kan APP worden gesplitst door proteasen genoemd α, β, γ-en secretasen 1. Sequentiële proteolytische splitsing van APP met β en γ-secretasen leidt tot de productie van een kleine proteolytische peptide, aangeduid Aß, dat amyloidogene en de kern bestanddeel van seniele plaques. De AICD is bevrijd van het membraan na secretase verwerking en via interacties met Fe65 en Tip60 kan naar de kern om aan transcriptie regulatie van meerdere doelgenen 2,3. Eiwit-eiwit interacties waarbij AICD kunnen beïnvloeden handel, verwerking en cellulaire functies van holo-APP en C-terminal fragmenten. We hebben onlangs aangetoond dat AICD kan totaal in vitro, en dit proces wordt geremd door de AD-betrokken moleculaire chaperonne ubiquilin-1 4. Consistent met deze bevindingen de AICD hydrofobe domeinen heeft belicht en intrinsiek ongeordend in vitro 5,6, maar het verkrijgt stabiele secundaire structuur wanneer gebonden aan Fe65 7. We hebben voorgesteld ubiquilin-1 ongepast inter-en intramoleculaire interacties van AICD voorkomt, waardoor aggregatie in vitro en in intacte cellen 4. Terwijl de meeste studies richten zich op de rol van APP in de pathogenese van AD, de rol van de AICD in dit proces is niet duidelijk. Expressie van AICD is aangetoond dat apoptose induceren 8, te moduleren signaalwegen 9, en calcium reguleren signalering 10. Over-expressie van AICD en Fe65 in een transgeen muismodel induceert Alzheimer pathologie zoals 11 en onlangs AICD is gedetecteerd in brain lysaten door western blotting, wanneer er gebruik geschikte antigeen retrieval technieken 12. Structurele, biochemische en biofysische studies van AICD vergemakkelijken, hebben we een procedure om recombinant grote hoeveelheden zeer zuivere eiwit AICD. We beschrijven verder een werkwijze voor het induceren van de in vitro aggregatie van thermische analyse door AICD en atomic force microscopie. De beschreven methoden zijn nuttig voor biochemische, biofysische en structurele karakterisering van de AICD en de effecten van moleculaire chaperones op AICD aggregatie.

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain at JoVE.com

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Werkwijze voor grootschalige zuivering van het APP intracellulaire domein (AICD) beschreven. We beschrijven ook de methodologie voor het induceren<em&gt; In vitro</em&gt; AICD aggregatie en visualisatie van atomaire kracht microscopie. De beschreven methoden zijn nuttig voor biochemische / structurele karakterisering van de AICD en de effecten van moleculaire chaperones op de aggregatie.

Zuivering en Aggregatie van het amyloïde voorlopereiwit intracellulaire domein

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Uitvoeren en verwerken van de FNA-anterior Fat Pad voor Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarkers in een diermodel voor het openbaren van Neural, hematologische, en gedragsmatige correlaten van PTSS

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Subretinale transplantatie van MACS gezuiverde fotoreceptor precursor cellen in de volwassen muis retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Synergetische gebruik van neurale precursoren en Zelfgeassembleerde Peptiden in Experimentele Baarmoederhalskanker Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&#946; and Tau Neuropathology

Evaluatie van spontane alternatie, herkenning van nieuwe objecten en limb clasping in transgene muismodellen van Amyloid-B en Tau Neuropathology

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetrie over menselijke gewassen bloedplaatjes: Het effect van de Pannexin1-remmer Brilliant Blue FCF op collageen geïnduceerde aggregatie

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Beoordeling van Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve en intracellulaire diastolische Calcium verwijdering in geïsoleerde ventriculaire Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

In Vivo Beeldvorming van Cx3cr1gfp/gfp Reporter muizen met spectrale domein optische coherentie tomografie en scannen Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Isolatie en zuivering van Murine cardiale Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

In situ leverperfusiemodel voor muizen om metabole reacties op substraten te bestuderen

Hepatic Glucose Production, Ureagenesis, and Lipolysis Quantified using the Perfused Mouse Liver Model

Auteur in de schijnwerpers: onderzoek naar leveraanpassingen en prediabetische progressie bij leverziekten 

Glucoseproductie in de lever, ureagenese en lipolyse gekwantificeerd met behulp van het geperfuseerde levermodel van muizen

The liver has numerous functions, including nutrient metabolism. In contrast to other in vitro and in vivo models of liver research, the isolated perfused ...