Name: purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain
Uploaded: 2012-08-28T12:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Hui Zheng (Baylor College of Medicine) pour l&#39;APP ADNc. Ce travail a été financé par des subventions du NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), le Mémorial John Sealy Fonds de dotation pour la recherche biomédicale (AFO), et le C. Jean et William D. Willis de recherche en neurosciences de dotation (ESS). JMB est un savant dans le programme de recherche translationnelle Scholar et un membre de l&#39;Université du Texas Medical Branch Claude E. Pepper Centre ancien indépendance Américains (soutenu par des subventions du NIH UL1RR029876 et P30-AG-024 832, respectivement).

<html> 1. Expression du recombinant domaine intracellulaire APP (AICD) <ol><li> Transform E. coli souche BL21 avec AICD humaine (résidus 649-695 de l&#39;APP, isoforme neuronale de numérotation) cloné dans le vecteur pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Ce vecteur exprimera AICD que le fragment C-terminal d&#39;une protéine de fusion de glutathion-S-transférase (GST). Ce vecteur code également pour une séquence de clivage de la thrombine pour faciliter le retrait du fragment GST. Détails du clonage AICD dans pGE...

<ol>
	<li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretases:+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease.">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li><li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein.">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li><li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FE65+proteins+and+Alzheimer's+disease.">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li><li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein.">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li><li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR.">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li><li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors.">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li><li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2.">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li><li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis.">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li><li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor.">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li><li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content.">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li><li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation.">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866 (2010).</li><li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue.">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li><li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein.">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li><li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA.">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li><li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-simultaneous+imaging/pulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy.">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).</li><li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain.">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li><li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1,+a+lipid+raft+protein.">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk.">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li><li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport,+amyloid+precursor+protein,+kinesin-1,+and+the+processing+apparatus:+revisited.">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li><li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase.">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li><li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+under+the+atomic+force+microscope.">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li></ol>

Dans ce protocole, nous avons décrit une procédure pour l&#39;obtention de l&#39;AICD très pur pour analyses structurales, biophysiques et biochimiques. Cette procédure ne nécessite pas de matériel sophistiqué et chromatographie est donc accessible à la plupart des laboratoires. D&#39;autres groupes ont purifié AICD 5-7,16, y compris la TPS-AICD 17-19, pour des analyses biochimiques / structurelle. Inconvénients aux protocoles précédents incluent une mauvaise solubilité de l&#39;AICD <...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> La thrombine </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilline </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> Réactif de Bradford dosage des protéines </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Bleu de Coomassie </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> Le glutathion-agarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> p-aminobenzamidine-agarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> Complete cocktail inhibiteur de la protéase </td><td> Roche </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> Cassettes de dialyse Slide-A-lyseur </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td> Colonnes de chromatographie </td><td> Evergreen Scientific </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> Émulsifiant </td><td> Avestin, Inc </td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td> Fortement recommandé </td></tr><tr><td> Eppendorf Thermomixer </td><td> Eppendorf </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> Disques de mica </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> Cantilevers AFM </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM logiciel </td><td> Nanotec </td><td> N / A </td><td> Free téléchargement </td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

La protéine précurseur de l&#39;amyloïde (APP) est une protéine transmembranaire de type I associée à la pathogenèse de la maladie d&#39;Alzheimer (MA). APP est caractérisé par un grand domaine extracellulaire et un domaine cytoplasmique court appelé le domaine intracellulaire APP (AICD). Au cours de maturation à travers la voie sécrétoire, l&#39;APP peut être clivée par des protéases appelées α, β, γ-sécrétase et 1. Séquentiel clivage protéolytique de l&#39;APP et de β γ-sécrétase conduit à la production d&#39;un peptide protéolytique petit Aß appelé, qui est amyloïdogénique et le constituant de noyau de plaques séniles. L&#39;AICD est aussi libérée de la membrane après traitement sécrétase, et à travers les interactions avec Fe65 et Tip60, peut translocation vers le noyau de participer à la régulation de la transcription de gènes cibles multiples 2,3. Interactions protéine-protéine impliquant l&#39;AICD peut affecter le trafic, le traitement et les fonctions cellulaires de holo-APP et son C-termifragments al. Nous avons récemment montré que l&#39;AICD peut agrégat in vitro, et ce processus est inhibé par le ubiquilin-1-AD en cause chaperon moléculaire 4. Conformément à ces résultats, l&#39;AICD a mis en évidence des domaines hydrophobes et est intrinsèquement désordonnés in vitro 5,6, mais il obtient une structure secondaire stable lorsqu&#39;elle est liée à Fe65 7. Nous avons proposé que ubiquilin-1 empêche inappropriées interactions inter-et intramoléculaire de l&#39;AICD, empêchant l&#39;agrégation in vitro et dans des cellules intactes 4. Alors que la plupart des études portent sur le rôle de l&#39;APP dans la pathogénie de la MA, le rôle de l&#39;AICD dans ce processus n&#39;est pas clair. Expression de l&#39;AICD a été montré pour induire l&#39;apoptose 8, pour moduler les voies de signalisation 9, et de réguler la signalisation calcique 10. La surexpression de l&#39;AICD et Fe65 dans un modèle de souris transgénique induit la maladie d&#39;Alzheimer, comme la pathologie 11, et récemment l&#39;AICD a été détecté en soutien-gorgedans les lysats par western blot en utilisant des techniques appropriées de récupération d&#39;antigène 12. Pour faciliter les études structurales, biochimiques et biophysiques de l&#39;AICD, nous avons développé une procédure pour produire des quantités importantes de protéine recombinante AICD très pur. En outre, nous décrivons une méthode pour induire l&#39;agrégation in vitro thermique de l&#39;AICD et l&#39;analyse par microscopie à force atomique. Les méthodes décrites sont utiles pour la caractérisation biochimique, biophysique et structurale de l&#39;AICD et les effets de chaperons moléculaires sur l&#39;agrégation AICD.

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Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Une méthode pour purification à grande échelle du domaine intracellulaire APP (AICD) est décrite. Nous décrivons également une méthodologie pour induire<em&gt; In vitro</em&gt; AICD l&#39;agrégation et la visualisation par microscopie à force atomique. Les méthodes décrites sont utiles pour la caractérisation biochimique / structurelle de l&#39;AICD et les effets de chaperons moléculaires sur son agrégation.

La purification et l&#39;agrégation de la protéine précurseur amyloïde domaine intracellulaire

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Exécution et traitement des FNA coussinet adipeux antérieure de l&#39;amyloïde

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

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