Name: purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain
Uploaded: 2012-08-28T12:00:00
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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) für die APP cDNA danken. Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), die John Sealy Memorial Endowment Fund for Biomedical Research (AFO) und der Jean C. und William D. Willis Neuroscience Research Endowment finanziert (ESS). JMB ist ein Gelehrter in der Translational Research Scholar Program und ein Mitglied der University Of Texas Medical Branch Claude E. Pfeffer Ältere Amerikaner Independence Center (unterstützt durch NIH Grants UL1RR029876 und P30-AG-024.832, jeweils).

<html> Ein. Expression von rekombinantem APP intrazelluläre Domäne (AICD) <ol><li> Transform E. coli-Stamm BL21 mit menschlichen AICD (Reste 649-695 von APP, neuronale Isoform Nummerierung) in den Vektor pGEX-4T-1 (GE Healthcare) kloniert. Dieser Vektor wird als C-terminalen Teil eines Fusionsprotein von Glutathion-S-Transferase (GST) AICD exprimieren. Dieser Vektor kodiert für ein Thrombin auch Spaltsequenz um das Entfernen des GST-Einheit zu erleichtern. Details Klonierung in pGEX-4T-1 AICD finden Sie in ...

<ol>
	<li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretases:+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease.">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li><li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein.">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li><li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FE65+proteins+and+Alzheimer's+disease.">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li><li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein.">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li><li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR.">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li><li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors.">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li><li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2.">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li><li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis.">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li><li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor.">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li><li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content.">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li><li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation.">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866 (2010).</li><li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue.">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li><li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein.">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li><li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA.">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li><li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-simultaneous+imaging/pulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy.">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).</li><li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain.">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li><li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1,+a+lipid+raft+protein.">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk.">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li><li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport,+amyloid+precursor+protein,+kinesin-1,+and+the+processing+apparatus:+revisited.">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li><li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase.">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li><li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+under+the+atomic+force+microscope.">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li></ol>

In diesem Protokoll haben wir ein Verfahren zur Gewinnung von hochreinem AICD für strukturelle, biophysikalischen und biochemischen Analysen skizziert. Dieses Verfahren erfordert keine ausgeklügelte Chromatographie Geräte und ist damit zugänglich für die meisten Laboratorien. Andere Gruppen haben AICD 5-7,16 gereinigt, einschließlich GST-AICD 17-19, für biochemische / Strukturanalysen. Nachteile zu früheren Protokollen gehören schlechte Löslichkeit von AICD 16, weniger als idea...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> Thrombin </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> Bradford-Protein-Assay-Reagenz </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Coomassie-Blau </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> Glutathion-Agarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> p-Aminobenzamidin-Agarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> Komplette Proteaseinhibitor-Cocktail </td><td> Roche </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer Dialyse Kassetten </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td> Chromatographiesäulen </td><td> Evergreen Scientific </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> Emulgator </td><td> Avestin, Inc. </td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td> Highly recommended </td></tr><tr><td> Eppendorf Thermomixer </td><td> Eppendorf </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> Mica Disks </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> AFM Cantilever </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM Software </td><td> Nanotec </td><td> N / A </td><td> Free Download </td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

Amyloid-Vorläuferprotein (APP) ist ein Typ I Transmembran-Proteins mit der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit (AD) zugeordnet ist. APP wird durch einen großen extrazellulären Domäne und einer kurzen zytosolische Domäne bezeichnet das APP intrazelluläre Domäne (AICD) aufweist. Während der Reifung durch den sekretorischen Weg, kann APP durch Proteasen genannt α, β und γ-Sekretase 1 gespalten werden. Sequentielle proteolytische Spaltung von APP mit β und γ-Sekretasen führt zu der Produktion eines kleinen Peptids proteolytische, genannt Aß, das amyloidogene ist und der Kernbestandteil von senilen Plaques. Die AICD ist auch befreit von der Membran nach Sekretase Verarbeitung und durch Interaktionen mit Fe65 und Tip60 kann in den Kern in Transkriptionsregulation mehrerer Zielgene 2,3 teilzunehmen translozieren. Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen den AICD beeinträchtigen Menschenhandel, Verarbeitung und zelluläre Funktionen von Holo-APP und seine C-terminal Fragmente. Wir haben kürzlich gezeigt, dass AICD wird Aggregat kann in vitro, und dieser Prozess durch den AD-verwickelt molekularen Chaperon Ubiquilin-1 4 inhibiert. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen, die AICD hat hydrophoben Domänen ausgesetzt und ist untrennbar in vitro 5,6 ungeordnet, aber es erhält stabile sekundäre Struktur, wenn sie Fe65 7 gebunden. Wir haben vorgeschlagen, dass Ubiquilin-1 unangemessen inter-und intramolekulare Wechselwirkungen von AICD verhindert die Aggregation in vitro und in intakten Zellen 4. Während die meisten Studien über die Rolle von APP in der Pathogenese von AD zu konzentrieren, ist die Rolle in diesem Prozess AICD nicht klar. Expression AICD hat sich gezeigt, Apoptose zu induzieren 8, zu modulieren Signalwege 9 und zum Calcium regulieren Signalisierung 10. Überexpression von AICD und Fe65 in einer transgenen Mausmodell induziert wie Alzheimer Pathologie 11, und vor kurzem hat AICD in BH nachgewiesenin Lysaten mittels Western Blot, wenn mit geeigneten Antigen-Retrieval-Techniken 12. Um strukturelle, biochemische und biophysikalische Untersuchungen des AICD erleichtern, haben wir ein Verfahren zur rekombinanten große Mengen an hochreinem AICD Protein produzieren. Wir beschreiben außerdem ein Verfahren zur Induktion der in vitro thermische Aggregation AICD und Analyse mittels Rasterkraftmikroskopie. Die beschriebenen Methoden sind für biochemische, biophysikalische und strukturelle Charakterisierung des AICD und die Auswirkungen der molekularen Chaperone auf AICD Aggregation nützlich.

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Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Ein Verfahren für die großtechnische Reinigung des APP intrazelluläre Domäne (AICD) beschrieben. Wir beschreiben auch Methoden zu induzieren<em&gt; In vitro</em&gt; AICD Aggregation und Visualisierung mittels Rasterkraftmikroskopie. Die beschriebenen Methoden sind nützlich für biochemische / strukturelle Charakterisierung der AICD und die Auswirkungen der molekularen Chaperone auf die Aggregation.

Reinigung und Aggregation des Amyloid Precursor Protein intrazelluläre Domäne

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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