Name: purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain
Uploaded: 2012-08-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר הואי ג&#39;נג (יילור לרפואה) לAPP cDNA. עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (עף), קרן ג&#39;ון סילי הזכרון הקרן למחקר ביו (עף), וז&#39;אן וג ויליאם ד ויליס Neuroscience Research קרן (ESS). JMB הוא חוקר בתכנית למלגת מחקר Translational וחבר באוניברסיטת טקסס רפואית סניף קלוד E. פלפל ישן יותר עצמאות מרכז האמריקנים (נתמך על ידי מענקי NIH UL1RR029876 וP30-AG-024832, בהתאמה).

<html> 1. ביטוי של רקומביננטי דומיין התאי APP (AICD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transform E. coli להתאמץ BL21 עם AICD אדם (שאריות 649-695 של APP, עצבי איזופורם מספור) משובט לתוך וקטור pGEX-4T-1 (GE Healthcare). הווקטור הזה יבטא AICD כמחצית C-המסוף של חלבון היתוך של-transferase גלוטתיון S ...

<ol>
	<li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretases:+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease.">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li><li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein.">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li><li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FE65+proteins+and+Alzheimer's+disease.">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li><li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein.">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li><li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR.">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li><li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors.">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li><li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2.">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li><li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis.">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li><li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor.">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li><li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content.">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li><li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation.">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866 (2010).</li><li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue.">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li><li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein.">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li><li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA.">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li><li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-simultaneous+imaging/pulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy.">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).</li><li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain.">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li><li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1,+a+lipid+raft+protein.">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk.">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li><li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport,+amyloid+precursor+protein,+kinesin-1,+and+the+processing+apparatus:+revisited.">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li><li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase.">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li><li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+under+the+atomic+force+microscope.">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li></ol>

בפרוטוקול זה גבשנו הליך לקבלת AICD הטהור ביותר עבור ניתוחים מבניים, biophysical, וביוכימיים. הליך זה אינו דורש ציוד מתוחכם כרומטוגרפיה ולכן הוא נגיש לרוב המעבדות. קבוצות אחרות לא מטוהרות AICD 5-7,16, כולל GST-AICD 17-19, לניתוחים ביוכימיים / מבניים. חסרונות לפרוטוקולים קודמ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> תרומבין </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> אמפיצילין </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> מגיב assay חלבון ברדפורד </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Coomassie כחול </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (thiogalactopyranoside איזופרופיל-beta-D) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> גלוטתיון-agarose </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> p-aminobenzamidine-agarose </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> קוקטייל מעכב פרוטאז מלא </td><td> רוש </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> קלטות דיאליזת Slide-A-Lyzer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td> עמודות כרומטוגרפיה </td><td> מדעי אוורגרין </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> מתחלב </td><td> Avestin, Inc </td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td> מומלץ ביותר </td></tr><tr><td> אפנדורף Thermomixer </td><td> אפנדורף </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> דיסקים יציצו </td><td> טד פלה </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> cantilevers AFM </td><td> ברוקר </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM תוכנה </td><td> Nanotec </td><td> N / </td><td> Free הורדה </td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

חלבון מבשר עמילואיד (APP) הוא חלבון הטרנסממברני אני סוג קשור בפתוגנזה של המחלה (לספירה) אלצהיימר. APP מאופיין בתחום תאי גדול ותחום cytosolic קצר כינה התחום התאי APP (AICD). במהלך התבגרות דרך מסלול ההפרשה, APP ניתן בקע ידי פרוטאזות המכונות α, β, וγ-secretases 1. מחשוף פרוטאוליטי רציף של APP עם β-γ וsecretases מוביל לייצור של פפטיד קטן פרוטאוליטי, Aβ כינה, שהוא amyloidogenic ומרכיב הליבה של פלאק סנילי. AICD גם משוחרר מהקרום לאחר עיבוד סקרטאז, ובאמצעות אינטראקציות עם Fe65 וTip60, יכולה translocate לגרעין להשתתף בויסות שעתוק של גני המטרה מרובים 2,3. אינטראקציות בין חלבונים המעורבים AICD עשויות להשפיע על סחר, עיבוד, ופונקציות סלולריות של הולוגרמות APP וC-terminברי al. אנחנו הראינו לאחרונה שAICD יכול המצרפי במבחנה, ותהליך זה מעוכב על ידי ubiquilin-1 מלווה AD-מעורב מולקולרי 4. באופן עקבי עם ממצאים אלה, AICD חשף תחומים הידרופובי והוא מהותי מופרע במבחנת 5,6, אולם זה מקבל מבנה שניוני יציב כאשר חייב Fe65 7. אנחנו הצענו שubiquilin-1 מונע אינטראקציות בין intramolecular ולא תקינות של AICD, מניעת צבירה במבחנה בתאים שלמים 4. בעוד שרוב המחקרים מתמקדים בתפקידו של APP בפתוגנזה של ספירה, את התפקיד של AICD בתהליך זה אינו ברור. ביטוי של AICD הוכח לגרום לאפופטוזיס 8, לווסת את מסלולי איתות 9, ולהסדיר סיד איתות 10. על הביטוי של AICD וFe65 במודל עכבר מהונדס גורם אלצהיימר כמו 11 פתולוגיה, ולאחרונה AICD זוהה בחזייהבlysates ידי מערבי סופג בעת שימוש בטכניקות אחזור אנטיגן מתאימות 12. כדי להקל על מחקרים מבניים, ביוכימי, וbiophysical של AICD, פתח הליך כדי לייצר כמויות גדולות של חלבון recombinantly AICD הטהור ביותר. בנוסף, אנו מתארים שיטה לזירוז בצבירת תרמית מבחנה של AICD וניתוח על ידי מיקרוסקופ כוח האטומי. בשיטות המתוארות שימושיות לאפיון ביוכימי, biophysical, ומבני של AICD ואת ההשפעות של מלווים מולקולריים על צבירת AICD.

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain at JoVE.com

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

שיטה לטיהור בקנה מידה גדולה של התחום התאי APP (AICD) מתוארת. גם אנו מתארים שיטה כדי לגרום<em&gt; במבחנה</em&gt; צבירת AICD והדמיה על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. בשיטות המתוארות שימושיות לאפיון ביוכימי / המבני של AICD ואת ההשפעות של מלווים מולקולריים על הצבירה שלו.

טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

ביצוע ועיבוד FNA של Pad שומן Anterior עבור עמילואיד

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

השתלת Subretinal של MACS מטוהרים פוטורצפטור קודמן תאים לתוך הרשתית עכבר בוגר

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

שימוש סינרגטי של תאים עצביים מבשר ופפטידים עצמי הרכבה בפגיעה בחוט השדרה הניסויית צוואר הרחם

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&#946; and Tau Neuropathology

הערכה של חלופה ספונטנית, זיהוי אובייקטים רומנטי ו Clbing איברים מודלים עכבר מהונדס של Amyloid-β ו נוירופתולוגיה טאו

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetry על אדם שנשטף טסיות: השפעת מעכבי Pannexin1 FCF הכחול המבריק על צבירה מושרת קולגן

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

הערכה של רשת Sarcoplasmic סידן סידן הדיאסטולי שימור, תאיים הסרת Cardiomyocytes חדרית מבודד

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

אין ויוו הדמיה של עכברים כתב Cx3cr1gfp/gfp עם תחומים הספקטרום טומוגרפיה אופטית קוהרנטית, סריקת לייזר Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

בידוד וטיהור של קרום הלב של מורלין

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

מודל זילוח כבד של עכבר באתרו לחקר תגובות מטבוליות למצעים

Hepatic Glucose Production, Ureagenesis, and Lipolysis Quantified using the Perfused Mouse Liver Model

מחבר זרקור: חקירת הסתגלויות בכבד והתקדמות טרום סוכרתית במחלות כבד 

ייצור גלוקוז בכבד, אורגנזה וליפוליזה מכומתים באמצעות מודל הכבד של עכבר מחורר

The liver has numerous functions, including nutrient metabolism. In contrast to other in vitro and in vivo models of liver research, the isolated perfused ...