Name: purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain
Uploaded: 2012-08-28T12:00:00
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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) para a APP cDNA. Este trabalho foi financiado pelo NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), o John Sealy Memorial Fund Endowment for Biomedical Research (AFO), e Jean C. e D. William Willis Neuroscience Research Endowment (ESS). JMB é um estudioso do Programa de Pesquisa Translacional Scholar e membro da Universidade do Texas Medical Sucursal Claude E. Pimenta antiga americanos Independência Centro (apoiado pelo NIH UL1RR029876 e P30-AG-024832, respectivamente).

<html> 1. Expressão de domínio recombinante APP intracelular (AICD) <ol><li> E. Transformação coli BL21 com AICD humana (resíduos 649-695 de APP, isoforma neuronal de numeração) clonado no vector pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Este vector expressará AICD como a porção C-terminal de uma proteína de fusão de glutationa-S-transferase (GST). Este vector também codifica uma sequência de clivagem pela trombina para facilitar a remoção da porção GST. Detalhes da clonagem AICD em pGEX-4T-1 pode ...

<ol>
	<li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretases:+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease.">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li><li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein.">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li><li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FE65+proteins+and+Alzheimer's+disease.">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li><li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein.">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li><li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR.">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li><li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors.">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li><li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2.">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li><li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis.">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li><li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor.">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li><li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content.">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li><li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation.">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866 (2010).</li><li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue.">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li><li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein.">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li><li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA.">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li><li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-simultaneous+imaging/pulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy.">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).</li><li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain.">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li><li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1,+a+lipid+raft+protein.">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk.">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li><li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport,+amyloid+precursor+protein,+kinesin-1,+and+the+processing+apparatus:+revisited.">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li><li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase.">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li><li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+under+the+atomic+force+microscope.">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li></ol>

Neste protocolo temos delineado um procedimento para obter AICD altamente puro para análises estruturais, biofísicos e bioquímicos. Este procedimento não requer equipamento sofisticado cromatografia e é, portanto, acessível para a maioria dos laboratórios. Outros grupos têm purificada AICD 5-7,16, incluindo GST-AICD 17-19, para as análises bioquímicas / estrutural. Desvantagens aos protocolos anteriores incluem fraca solubilidade do AICD 16, menos do que ideal pureza 17,</...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> Trombina </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> Bradford reagente de ensaio de proteínas </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Coomassie azul </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (isopropil-beta-D tiogalactopiranósido) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> Glutationa-agarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> p-aminobenzamidina-agarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> Cocktail inibidor de protease completo </td><td> Roche </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer cassetes de diálise </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td> Colunas de cromatografia </td><td> Scientific Evergreen </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> Emulsificante </td><td> Avestin, Inc </td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td> Altamente recomendado </td></tr><tr><td> Eppendorf Thermomixer </td><td> Eppendorf </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> Discos de mica </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> Cantilevers de AFM </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM software </td><td> Nanotec </td><td> N / A </td><td> Free Download </td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

Proteína precursora amilóide (APP) é uma proteína transmembranar de tipo I associado à patogénese da doença de Alzheimer (AD). APP é caracterizada por um grande domínio extracelular e um domínio citosólico curto denominado o domínio intracelular de APP (AICD). Durante a maturação através da via secretora, APP pode ser clivada por proteases denominadas α, β e γ-secretases 1. A clivagem proteolítica da APP sequencial com β e γ-secretases conduz à produção de um péptido pequeno proteolítico, denominado de Ap, que é amiloidogénica e o constituinte principal das placas senis. A AICD também é libertada a partir da membrana, após o processamento secretase, e por meio de interacções com Fe65 e Tip60, pode translocar para o núcleo para participar na regulação da transcrição de genes alvo múltiplas 2,3. Interacções proteína-proteína envolvendo a AICD podem afectar o tráfico, o processamento e as funções celulares de holo-APP e seus C-terminfragmentos al. Mostrámos recentemente que AICD pode agregar in vitro, e este processo é inibido pelo ubiquilin-1-AD implicado chaperone molecular 4. Consistente com estes resultados, a AICD expôs domínios hidrofóbicos e está intrinsecamente desordenados in vitro 5,6, no entanto, obtém estrutura secundária estável quando ligado ao Fe65 7. Propusemos que ubiquilin-1 impede inadequado interacções inter-e intramolecular da AICD, prevenindo a agregação in vitro e em células intactas 4. Enquanto a maioria dos estudos focado o papel de APP na patogénese de AD, o papel da AICD neste processo não são claras. Expressão da AICD foi mostrado para induzir a apoptose 8, para modular as vias de sinalização 9, e para regular a sinalização de cálcio 10. A sobre-expressão da AICD e Fe65 num modelo de ratinho transgénico induz patologia de Alzheimer, como 11, e recentemente AICD foi detectado no braem lisados ​​por western blotting quando usando técnicas de recuperação de antigénios apropriados 12. Para facilitar os estudos estruturais, bioquímicas e biofísicas da AICD, desenvolvemos um procedimento para a produção de quantidades grandes de forma recombinante altamente pura proteína AICD. Iremos descrever um método para a indução in vitro da agregação térmica da AICD e análise por microscopia de força atómica. Os métodos descritos são úteis para a caracterização bioquímica, biofísica e estrutural da AICD e os efeitos das chaperones moleculares na agregação AICD.

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Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Um método para a purificação em larga escala do domínio intracelular de APP (AICD) é descrita. Nós também descrevem metodologia de indução<em&gt; In vitro</em&gt; Agregação AICD e visualização por microscopia de força atômica. Os métodos descritos são úteis para a caracterização bioquímica / estrutural da AICD e os efeitos das chaperones moleculares sobre a sua agregação.

Purificação e Agregação do Domínio proteína precursora de amilóide intracelular

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