Name: purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain
Uploaded: 2012-08-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Хуэй Чжэн (Медицинского колледжа Бэйлора) для APP кДНК. Эта работа финансировалась грантами NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (АФК), Джон Сили мемориальный благотворительный фонд для биомедицинских исследований (АФК), и Жан С. и Уильяма Д. Уиллис Neuroscience исследований фонда (ESS). JMB является ученым в Поступательное Программа научный сотрудник и член Техасском университете Медицинского отделения Клод Пеппер пожилых американцев Независимости центра (при поддержке грантов NIH UL1RR029876 и P30-AG-024 832, соответственно).

<html> 1. Экспрессия рекомбинантного APP внутриклеточного домена (AICD) <ol><li> Transform E. Штамм BL21 с человеческим AICD (остатки 649-695 АРР, нейронные изоформы нумерации) клонировали в векторе pGEX-4Т-1 (GE Healthcare). Этот вектор будет выражать AICD как С-концевой фрагмент гибридный белок глутатион-S-трансфера...

<ol>
	<li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretases:+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease.">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li><li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein.">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li><li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FE65+proteins+and+Alzheimer's+disease.">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li><li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein.">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li><li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR.">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li><li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors.">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li><li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2.">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li><li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis.">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li><li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor.">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li><li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content.">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li><li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation.">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866 (2010).</li><li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue.">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li><li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein.">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li><li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA.">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li><li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-simultaneous+imaging/pulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy.">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).</li><li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain.">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li><li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1,+a+lipid+raft+protein.">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk.">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li><li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport,+amyloid+precursor+protein,+kinesin-1,+and+the+processing+apparatus:+revisited.">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li><li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase.">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li><li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+under+the+atomic+force+microscope.">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li></ol>

В этом протоколе мы наметили порядок получения особо чистой AICD для структурных, биофизических и биохимических анализов. Эта процедура не требует сложного оборудования хроматографии и, следовательно, доступными для большинства лабораторий. Другие группы, очистив AICD 5-7,16, в том чи?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> pGEX-4Т-1 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> Тромбин </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> Ампициллин </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> Bradford анализа белка реагентов </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Кумасси синим </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (изопропил-бета-D тиогалактопиранозид) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> Глутатион-агарозы </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tг&gt; <td> р-aminobenzamidine-агарозы </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> Полное коктейля ингибитора протеазы </td><td> Roche </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> Слайд-A-анализатора кассеты диализа </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td> Хроматографические колонки </td><td> Evergreen Научные </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> Эмульгатор </td><td> Авестина, Inc </td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td> Настоятельно рекомендуется </td></tr><tr><td> Eppendorf Thermomixer </td><td> Eppendorf </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> Слюда дисков </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> AFM консолей </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM программного обеспечения </td><td> Nanotec </td><td> N / A </td><td> Frе скачать </td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

Белка-предшественника амилоида (APP) представляет собой трансмембранный типа я белка, связанного с патогенезом болезни Альцгеймера (AD). APP характеризуется большой внеклеточный домен и короткий цитозольного домена называется APP внутриклеточного домена (AICD). Во время созревания через секреторный путь, APP могут расщепляться протеазами называется α, β, γ и-секретазы 1. Последовательное протеолитического расщепления APP с β и γ-секретазы приводит к образованию небольшого пептида протеолитические, называется Ар, который является амилоидогенных и основной составляющей старческих бляшек. AICD также освобожден от мембраны после обработки секретазы, и через взаимодействие с Fe65 и Tip60, можно перемещать в ядро участвовать в регуляции транскрипции нескольких генов-мишеней 2,3. Белок-белковые взаимодействия, связанные с AICD могут повлиять на торговлю, обработку и клеточных функций голо-APP и C-терминологиюАль-фрагментов. Недавно мы показали, что AICD можете совокупности в пробирке, и этот процесс тормозится AD-замешан молекулярного шаперона ubiquilin-1 4. В соответствии с этими выводами, AICD выявила гидрофобных доменов, и внутренне неупорядоченным в пробирке 5,6, однако он получает стабильную вторичную структуру при связывании с Fe65 7. Мы предположили, что ubiquilin-1 предотвращает нарушение меж-и внутримолекулярных взаимодействий AICD, предотвращая агрегацию в пробирке и в неповрежденные клетки 4. Хотя большинство исследований сосредоточена на роли АЭС в патогенезе БА, роль AICD в этом процессе не ясно. Выражение AICD было показано, индуцируют апоптоз 8, для модуляции сигнальных путей, 9 и регулировать кальция сигнализации 10. Сверхэкспрессия AICD и Fe65 в трансгенных мышах вызывает болезнь Альцгеймера, как патология 11, а в последнее время AICD был обнаружен в бюстгальтерВ лизатов с помощью вестерн-блоттинга при использовании соответствующего антигена поиска методов 12. Для облегчения структурных, биохимических и биофизических исследований AICD, мы разработали процедуру для получения рекомбинантных большого количества очень чистой AICD белка. Мы также описать способ индуцирования в пробирке тепловой агрегации AICD и анализ атомно-силовой микроскопии. Методы, описанные полезны для биохимических, биофизических и структурных характеристик AICD и последствия молекулярных шаперонов на AICD агрегации.

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain at JoVE.com

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Метод крупномасштабной очистки APP внутриклеточного домена (AICD) описывается. Мы также описать методологию, чтобы побудить<em&gt; В пробирке</em&gt; AICD агрегирования и визуализации атомно-силовой микроскопии. Описанные методы могут быть использованы для биохимических / структурных характеристик AICD и последствия молекулярных шаперонов на его агрегации.

Очистка и агрегации белка-предшественника амилоида внутриклеточного домена

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Выполнение и обработка FNA Передней жировой ткани для амилоида

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Биомаркеры в животной модели для выявления нервных, гематологических, и поведенческие корреляты посттравматического стрессового расстройства

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Computed Tomography-guided Time-domain Diffuse Fluorescence Tomography in Small Animals for Localization of Cancer Biomarkers

Компьютерная томография наведением во временной области диффузного флуоресцентная томография у мелких животных для локализации рака биомаркеров

Small animal fluorescence molecular imaging (FMI) can be a powerful tool for preclinical drug discovery and development studies1. However, light ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Субретинальная трансплантация macS Очищенные клетки-предшественники фоторецептора в сетчатку взрослой мыши

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Синергетический использованием нейронных клеток-предшественников и самоорганизации пептидов в экспериментальном шейного отдела спинного мозга Травма

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Количественный 3D<em&gt; В Silico</em&gt; Моделирование (q3DISM) церебрального бета-амилоида Фагоцитоз в моделях грызунов болезни Альцгеймера

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&#946; and Tau Neuropathology

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² and Tau Neuropathology

Оценка спонтанной чередования, распознавания новых предметов и смыкания конечностей в трансгенных моделях мышей амилоидной и тау-нейропатологии

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Турбидиметрия на человеке промытых тромбоциты: Влияние Pannexin1-ингибитор Brilliant Blue FCF на индуцированный коллаген агрегации

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Оценка саркоплазматический ретикулум кальция резерва и внутриклеточного кальция диастолического удаления в изолированных кардиомиоцитов желудочков

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

В естественных условиях Визуализация Cx3cr1gfp/gfp репортер мышей с спектральные домена оптическая когерентная томография и сканирование лазерная офтальмоскопия

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...