Name: purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain
Uploaded: 2012-08-28T12:00:00
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Los autores desean agradecer al Dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) para la APP cDNA. Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), el Memorial Juan Sealy Fondo de Dotación para la Investigación Biomédica (AFO), y el C. Jean y William D. Willis Fundación de Investigación de Neurociencia (ESS). JMB es un erudito en el Programa de Investigación Traslacional Académico y miembro de la Universidad de Texas Medical Branch Claude E. Pepper Older Independencia estadounidenses Center (apoyado por el NIH subvenciones UL1RR029876 y P30-AG-024.832, respectivamente).

<html> 1. Expresión recombinante de dominio intracelular APP (AICD) <ol><li> Transformar E. coli cepa BL21 con AICD humana (residuos 649-695 de APP, neuronal numeración isoforma) clonado en el vector pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Este vector se expresa por AICD como el resto C-terminal de una proteína de fusión de glutatión-S-transferasa (GST). Este vector también codifica una secuencia de escisión de trombina para facilitar la eliminación de la fracción GST. Los detalles de la clonación AICD en pGEX-4T...

<ol>
	<li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretases:+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease.">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li><li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein.">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li><li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FE65+proteins+and+Alzheimer's+disease.">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li><li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein.">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li><li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR.">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li><li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors.">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li><li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2.">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li><li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis.">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li><li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor.">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li><li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content.">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li><li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation.">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866 (2010).</li><li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue.">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li><li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein.">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li><li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA.">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li><li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-simultaneous+imaging/pulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy.">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).</li><li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain.">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li><li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1,+a+lipid+raft+protein.">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk.">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li><li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport,+amyloid+precursor+protein,+kinesin-1,+and+the+processing+apparatus:+revisited.">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li><li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase.">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li><li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+under+the+atomic+force+microscope.">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li></ol>

En este protocolo hemos descrito un procedimiento para la obtención de DAI de alta pureza para análisis estructurales, biofísicos y bioquímicos. Este procedimiento no requiere un equipo sofisticado y cromatografía es por tanto accesible a la mayoría de los laboratorios. Otros grupos han purificado AICD 5-7,16, incluyendo GST-AICD 17-19, para los análisis bioquímicos / estructural. Las desventajas de los protocolos anteriores incluyen mala solubilidad de AICD 16, menos de pureza i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> La trombina </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicilina </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> Proteína Bradford ensayo de reactivos </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de Coomassie </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (isopropil-beta-D tiogalactopiranósido) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> Glutatión-agarosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> p-aminobenzamidina-agarosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> Proteasa completo cóctel inhibidor </td><td> Roche </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer cassettes de diálisis </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td> Columnas para cromatografía </td><td> Evergreen Scientific </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> Emulsionante </td><td> Avestin, Inc </td><td> Emulsiflex-C3 </td><td> Altamente recomendado </td></tr><tr><td> Eppendorf Thermomixer </td><td> Eppendorf </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> Mica discos </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> AFM voladizos </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM software </td><td> Nanotec </td><td> N / A </td><td> P.ee descarga </td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

Proteína precursora de amiloide (APP) es una proteína transmembrana de tipo I asociado con la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer (AD). APP se caracteriza por un gran dominio extracelular y un dominio citosólico corto denominado el dominio intracelular de APP (AICD). Durante la maduración a través de la vía secretora, APP puede ser escindida por proteasas denominadas α, β, y γ-secretasas 1. La escisión proteolítica de APP secuencial con β y γ-secretasas conduce a la producción de un péptido pequeño proteolítica, Aß denomina, que es amiloidogénica y el constituyente principal de las placas seniles. La AICD también es liberado de la membrana después de la elaboración secretasa, y a través de las interacciones con Fe65 y Tip60, puede trasladar al núcleo de participar en la regulación de la transcripción de genes diana múltiples 2,3. Interacciones proteína-proteína que implican la AICD pueden afectar el tráfico, el procesamiento y las funciones celulares de holo-APP y su C-terminfragmentos col. Recientemente hemos demostrado que puede AICD agregado in vitro, y este proceso se inhibe por la ubiquitina-1 AD-implicado chaperona molecular 4. Consistente con estos hallazgos, la AICD ha expuesto dominios hidrófobos y está intrínsecamente desordenados in vitro 5,6, sin embargo se obtiene una estructura secundaria estable cuando está unido a Fe65 7. Hemos propuesto que la ubiquitina-1 previene apropiado interacciones inter-e intramolecular de la AICD, prevenir la agregación in vitro y en células intactas 4. Mientras que la mayoría de los estudios se centran en el papel de APP en la patogénesis de la EA, el papel de la AICD en este proceso no está claro. Expresión de AICD se ha demostrado que induce la apoptosis 8, para modular las vías de señalización 9, y para regular la señalización de calcio 10. La sobreexpresión de la AICD y Fe65 en un modelo de ratón transgénico induce patología de Alzheimer como 11, y recientemente AICD se ha detectado en el sujetadoren lisados ​​por Western Blot utilizando las técnicas apropiadas de recuperación de antígeno 12. Para facilitar estudios estructurales, bioquímicos y biofísicos de la AICD, se ha desarrollado un procedimiento para producir cantidades grandes de proteína recombinante AICD altamente puro. Nos describen además un método para inducir la agregación en vitro térmica de AICD y el análisis por microscopía de fuerza atómica. Los métodos descritos son útiles para la caracterización bioquímica, biofísica y estructural de la AICD y los efectos de las chaperonas moleculares sobre la agregación de AICD.

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Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Un método para la purificación a gran escala del dominio intracelular de APP (AICD) se describe. También describe la metodología para inducir<em&gt; In vitro</em&gt; AICD agregación y visualización por microscopía de fuerza atómica. Los métodos descritos son útiles para la caracterización bioquímica / estructural de la AICD y los efectos de las chaperonas moleculares en su agregación.

La purificación y la agregación de la proteína precursora amiloide del dominio intracelular

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Realización y procesamiento de la PAAF de almohadilla grasa anterior de amiloide

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Investigación

Medicina

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