Name: purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain
Uploaded: 2012-08-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Hui Zheng (Baylor College of Medicine) för APP cDNA. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), John Sealy Memorial Kapitalförsäkringar fonden för biomedicinsk forskning (AFO) samt Jean C. och William D. Willis Neuroscience Research Endowment (ESS). JMB är en lärd i translationell forskning Scholar Program och medlem av University of Texas Medical Branch Claude E. Pepper äldre amerikaner Independence Center (med stöd av NIH bidrag UL1RR029876 och P30-AG-024.832, respektive).

<html> 1. Uttryck av rekombinant APP intracellulär domän (AICD) <ol><li> Transformera E. coli stam BL21 med humant AICD (rester 649-695 av APP, neuronala isoformen numrering) klonad in pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Denna vektor uttrycker AICD som den C-terminala delen av ett fusionsprotein av glutation-S-transferas (GST). Denna vektor kodar också en trombin klyvningssekvens för att underlätta avlägsnande av GST-delen. Uppgifter om kloning AICD i pGEX-4T-1 finns i vår tidigare publikation 4. </li...

<ol>
	<li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretases:+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease.">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li><li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein.">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li><li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FE65+proteins+and+Alzheimer's+disease.">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li><li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein.">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li><li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR.">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li><li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors.">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li><li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2.">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li><li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis.">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li><li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor.">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li><li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content.">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li><li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation.">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866 (2010).</li><li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue.">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li><li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein.">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li><li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA.">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li><li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-simultaneous+imaging/pulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy.">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).</li><li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain.">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li><li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1,+a+lipid+raft+protein.">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk.">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li><li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport,+amyloid+precursor+protein,+kinesin-1,+and+the+processing+apparatus:+revisited.">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li><li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase.">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li><li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+under+the+atomic+force+microscope.">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li></ol>

I detta protokoll vi har beskrivit ett förfarande för att erhålla högren AICD för strukturella, biofysiska och biokemiska analyser. Detta förfarande kräver inte sofistikerade kromatografi utrustning och är därför tillgänglig för de flesta laboratorier. Andra grupper har renat AICD 5-7,16, inklusive GST-AICD 17-19, för biokemiska / strukturella analyser. Nackdelar med föregående protokollen är dålig löslighet AICD 16, mindre än idealisk renhet 17, och kravet ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> Trombin </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> Bradford-proteinanalys-reagens </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Coomassie blå </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (isopropyl-beta-D-tiogalaktopyranosid) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> Glutation-agaros </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> p-aminobensamidin-agaros </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> Komplett proteashämmare cocktail </td><td> Roche </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer dialys kassetter </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66.380 </td><td></td></tr><tr><td> Kromatografikolonner </td><td> Evergreen Scientific </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> Emulgeringsmedel </td><td> Avestin, Inc. </td><td> Emulsiflex-C3 </td><td> Highly recommended </td></tr><tr><td> Eppendorf Thermomixer </td><td> Eppendorf </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> Mica skivor </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> AFM utliggare </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM programvara </td><td> Nanotec </td><td> N / A </td><td> Free nedladdning </td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

Amyloid prekursorprotein (APP) är en typ I transmembranprotein i samband med patogenesen av Alzheimers sjukdom (AD). APP kännetecknas av en stor extracellulär domän och en kort cytosolisk domän kallas APP intracellulär domän (AICD). Under mognad genom den sekretoriska vägen, kan APP klyvas av proteaser kallade α, β, och γ-secretases 1. Sekventiell proteolytisk klyvning av APP med β och γ-secretases leder till produktion av en liten proteolytisk peptid, benämnd Ap, som är amyloidogena och kärnan beståndsdelen i senila plack. Den AICD är också befriad från membranet efter sekretas bearbetning och genom interaktioner med Fe65 och Tip60 kan translokeras till kärnan för att delta i transkriptionsreglering av flera målgener 2,3. Protein-protein interaktioner som involverar AICD kan påverka handeln, bearbetning och cellulära funktioner holo-APP och dess C-terminal-fragment. Vi har nyligen visat att AICD kan aggregat in vitro, och denna process hämmas av AD-inblandad molekylär kaperon ubiquilin-1 4. I överensstämmelse med dessa resultat har AICD utsatt hydrofoba domäner och är i sig störda in vitro 5,6, men den får stabil sekundär struktur vid bindning till Fe65 7. Vi har föreslagit att ubiquilin-1 förhindrar olämpliga inter-och intramolekylära interaktioner av AICD, förhindra aggregation in vitro och i intakta celler 4. Medan de flesta studier fokuserar på betydelsen av APP i patogenesen av AD, är den roll som AICD i denna process inte klart. Expression av AICD har visats inducera apoptos 8, att modulera signalvägar 9, och för att reglera kalcium signalering 10. Överuttryck av AICD och Fe65 i en transgen musmodell inducerar Alzheimers som patologi 11, och nyligen AICD har upptäckts i behåi lysat genom Western blotting vid användning lämpliga tekniker antigenåtervinning 12. För att underlätta strukturella, biokemiska och biofysiska studier av AICD, har vi utvecklat ett förfarande för att framställa rekombinant stora mängder mycket ren AICD protein. Vi beskriver vidare ett förfarande för att inducera in vitro termiska aggregering av AICD och analys med atomkraftsmikroskopi. De beskrivna metoderna är användbara för biokemisk, biofysik, och strukturella karakterisering av AICD och effekterna av molekylära chaperoner på AICD aggregering.

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain at JoVE.com

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

En metod för storskalig rening av APP intracellulär domän (AICD) beskrives. Vi beskriver också metoder för att inducera<em&gt; In vitro</em&gt; AICD aggregering och visualisering av atomkraftsmikroskopi. De beskrivna metoderna är användbara för biokemisk / strukturell karakterisering av AICD och effekterna av molekylära chaperoner på dess aggregering.

Rening och aggregation av amyloidprekursorproteinet intracellulära domänen

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Utföra och behandling FNA av främre Fat Pad för Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarkörer i en djurmodell för att avslöja Neurala, Hematologiska och Behavioral korrelat till PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Subretinal transplantation av MACS renad fotoreceptor prekursor celler i den vuxna mus näthinnan

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Synergi Användning av neurala prekursorceller och självorganiserande peptider i experimentell Cervical Ryggmärgsskada

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&#946; and Tau Neuropathology

Bedömning av spontan växelverkan, nyckelfunktionsgenkänning och limbindning i transgena musmodeller av Amyloid-P och Tau Neuropathology

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetri på Human Tvättade Trombocyter: Effekten av Pannexin1-hämmaren Brilliant Blue FCF på Kollageninducerad Aggregation

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Bedömning av sarkoplasmatiska nätmagen kalcium reserv och intracellulära diastoliskt kalcium borttagning i isolerade ventrikulära hjärtmuskelcellerna

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

In Vivo Avbildning av Cx3cr1gfp/gfp Reporter möss med Spectral-domän optisk koherenstomografi och Scanning Laser Oftalmoskopi

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Isolering och rening av murina hjärt pericyter

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

In situ musleverperfusionsmodell för att studera metabola svar på substrat

Hepatic Glucose Production, Ureagenesis, and Lipolysis Quantified using the Perfused Mouse Liver Model

Författare i fokus: Undersöker leveranpassningar och prediabetisk progression vid leversjukdomar 

Leverglukosproduktion, ureagenes och lipolys kvantifierad med hjälp av den perfunderade muslevermodellen

The liver has numerous functions, including nutrient metabolism. In contrast to other in vitro and in vivo models of liver research, the isolated perfused ...