Name: purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain
Uploaded: 2012-08-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain at JoVE.com

Yazarlar cDNA APP Dr Hui Zheng (Baylor College of Medicine) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), Biyomedikal Araştırma John Sealy Memorial Endowment Fund (AFO), ve Jean C. ve William D. Willis Nöroloji Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi (ESS). JMB Translasyonel Araştırmacı Programı, bir bilgin ve Texas Medical Branch Claude E. Pepper Eski Amerikalıların Bağımsızlık Merkezi Of Üniversitesi üyesi (NIH Grants sırasıyla UL1RR029876 ve P30-AG-024832, tarafından desteklenen) &#39;dir.

<html> 1. Rekombinant APP intrasellüler Domain (AICD) İfadesi <ol><li> Dönüşümü E. coli vektörü pGEX-4T-1 (GE Healthcare) klonlanmış insan AICD (artıkları APP 649-695, nöronal izoform numaralandırma) ile BL21 süzün. Bu vektör (GST), glutation-S-transferaz, bir füzyon proteininin C-terminal parçası olarak AICD ifade edecektir. Bu vektör de GST kısmının çıkarılmasını kolaylaştırmak için bir trombin bölünme sekansı kodlar. PGEX-4T-1&#39;e AICD klonlama Detaylar önceki yayında...

<ol>
	<li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretases:+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease.">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li><li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein.">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li><li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FE65+proteins+and+Alzheimer's+disease.">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li><li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein.">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li><li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR.">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li><li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors.">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li><li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2.">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li><li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis.">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li><li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor.">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li><li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content.">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li><li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation.">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866 (2010).</li><li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue.">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li><li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein.">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li><li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA.">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li><li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-simultaneous+imaging/pulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy.">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).</li><li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain.">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li><li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1,+a+lipid+raft+protein.">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk.">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li><li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport,+amyloid+precursor+protein,+kinesin-1,+and+the+processing+apparatus:+revisited.">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li><li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase.">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li><li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+under+the+atomic+force+microscope.">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li></ol>

Bu protokolü biz, yapısal biyofiziksel ve biyokimyasal analizler için son derece saf AICD elde etmek için bir prosedürü var. Bu işlem karmaşık kromatografi ekipman gerektiren ve bu nedenle birçok laboratuar erişilebilir değil. Diğer gruplar / biyokimyasal yapısal analizler için GST-AICD 17-19 dahil AICD 5-7,16 saflaştırılmış var. Önceki protokol dezavantajları zayıf AICD 16, çözünürlük, ideal bir saflık 17 den daha az, ve boyut dışlama 16</s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> Trombin </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> Ampisilin </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> Bradford protein tayini reaktifi </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Coomassie mavisi </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (izopropil-beta-D thiogalactopyranoside) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> Glutatyon-agaroz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> p-aminobenzamidine-agaroz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> Komple proteaz inhibitörü kokteyl </td><td> Roche </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer diyaliz kasetleri </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td> Kromatografi kolonları </td><td> Evergreen Bilimsel </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> Emülgatör </td><td> Avestin, Inc </td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td> Tavsiye </td></tr><tr><td> Eppendorf Thermomixer </td><td> Eppendorf </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> Mika Diskler </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> AFM konsollar </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM yazılım </td><td> Nanotec </td><td> N / A </td><td> Free indir </td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

Amiloid prekürsör protein (APP) Alzheimer hastalığı (AH) patogenezi ile ilişkili bir tip I transmembran proteindir. APP büyük ekstrasellüler domain ve APP hücre içi etki alanı (AICD) olarak adlandırılan kısa bir sitosolik etki ile karakterize edilir. Salgı yolu ile olgunlaşma sırasında, APP α, β, ve γ-secretases 1 olarak adlandırılan proteaz tarafından bölünebilir. Ve γ-β secretases ile APP ardışık proteolitik bölünme bir küçük peptid proteolitik olarak adlandırıldı, Aβ, amiloidojenik ve senil plaklar çekirdek bileşenin üretimine yol açar. AICD sekretaz işlendikten sonra da membran kurtarılmasının ve Fe65 ve Tip60 olan etkileşimleri sayesinde, birden fazla hedef genlerin 2,3 transkripsiyon regülasyonu katılmaya çekirdeğine doğru olabilir. AICD içeren protein-protein etkileşimleri ticareti, işlenmesi, ve sanal-APP ve C-termin hücresel fonksiyonları etkileyebilirark parçaları. Biz son zamanlarda AICD AD-karıştığı moleküler şaperon ubiquilin-1 4 tarafından inhibe edilir vitro agrega ve bu süreç olduğunu göstermiştir. Fe65 7 bağlı olduğunda bu bulgularla tutarlı olarak, AICD hidrofobik etki ortaya çıkarmıştır ve kendinden vitro 5,6 olarak bozulup, ancak kararlı ikincil yapı alır. Biz ubiquilin-1 in vitro ve 4 sağlam hücreleri agregasyonu engelleyen AICD uygunsuz arası ve molekül içi etkileşimleri engeller önerdi. Çalışmaların çoğu AD patogenezinde APP rolü üzerinde odaklanırken, bu süreçte AICD rolü net değildir. AICD ekspresyonu sinyal yollarının 9 modüle etmek için, apoptoz 8 indüklemek için, ve 10 sinyal kalsiyum düzenleme gösterilmiştir. Bir transgenik fare modelinde AICD ve Fe65 Over ifade patolojisi 11 gibi Alzheimer indükler ve son zamanlarda AICD sutyen tespit edildiUygun antijen geri kazanım teknikleri 12 kullanırken batı blot tarafından özütündeki. AICD yapısal, biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmaları kolaylaştırmak için, biz çok saf AICD protein Birleştirilerek büyük miktarlarda üretmek için bir prosedür geliştirmiştir. Daha ileri atomik kuvvet mikroskopi ile analiz AICD ve in vitro termal agregasyonu indüklenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Açıklanan yöntemler, biyokimyasal biyo-fiziksel, ve yapısal AICD karakterizasyonu ve AICD agregasyonu üzerinde moleküler şaperonlar etkileri için yararlıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain at JoVE.com

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

APP hücre içi etki alanı (AICD) büyük ölçekli arıtma için bir yöntem tarif edilmektedir. Ayrıca teşvik etmek için yöntemler tarifedilmiştir<em&gt; In vitro</emAtomik kuvvet mikroskobu ile&gt; AICD agregasyonu ve görselleştirme. Açıklanan yöntemler / biyokimyasal yapı AICD karakterizasyonu ve agregasyonu üzerinde moleküler şaperonlar etkileri için yararlıdır.

Amiloid prekürsör protein intrasellüler Domain saflaştırılması ve toplama

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Amiloid için Anterior Fat Pad FNA Sahne ve İşleme

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Tıp

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

TSSB, Nöral Hematolojik ve Davranış Bağlantılı Revealing için Hayvan Modelinde Biyobelirteçler

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

MACS Saflaştırılmış Fotoreceptör Öncü Hücrelerinin Yetişkin Fare Retinasına Subretinal Transplantasyonu

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Deneysel Servikal Spinal Kord Yaralanmalarında Sinir Öncü Hücreler ve Öz-montaj Peptitler sinerjik Kullanımı

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&#946; and Tau Neuropathology

Amiloid-β ve Tau Nöropatolojisinin Transgenik Fare Modellerinde Spontan Dalgalanmanın Değerlendirilmesi, Yeni Nesne Tanıma ve Limb Klapması

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Kollajen ile indüklenen on Aggregation Pannexin1-inhibitör Parlak Mavi FCF: Türbidimetrik İnsanlar üzerinde Trombositler Yıkanmış

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Sarcoplasmic retikulum kalsiyum koruma ve hücre içi diyastolik kalsiyum kaldırma izole Ventriküler Cardiomyocytes olarak değerlendirilmesi

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Vivo Tayf alanlı optik Koherens tomografi ve lazer Ophthalmoscopy tarama Cx3cr1gfp/gfp muhabir farelerin görüntüleme

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Murine Kardiyak Perisitlerin İzolasyon ve Safifikasyonu

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Substratlara Metabolik Tepkileri İncelemek için Yerinde Fare Karaciğer Perfüzyon Modeli

Hepatic Glucose Production, Ureagenesis, and Lipolysis Quantified using the Perfused Mouse Liver Model

Yazar Gündemi: Karaciğer Hastalıklarında Hepatik Adaptasyonların ve Prediyabetik İlerlemenin Araştırılması 

Hepatik Glikoz Üretimi, Ürejenez ve Lipoliz, Perfüze Fare Karaciğer Modeli Kullanılarak Ölçüldü

The liver has numerous functions, including nutrient metabolism. In contrast to other in vitro and in vivo models of liver research, the isolated perfused ...