Name: imaging calcium responses in gfp-tagged neurons of hypothalamic mouse brain slices
Uploaded: 2012-08-24T13:00:00
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Nous remercions nos collègues qui ont participé aux travaux résumés ici. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), «l&#39;analyse intégrative de l&#39;olfaction» du DFG Schwerpunktprogramm 1392 et par la Fondation Volkswagen (TLZ). TLZ est professeur Lichtenberg de la Fondation Volkswagen.

1. Préparation de la solution et gel d&#39;agarose <ol><li> Préparer la solution extracellulaire selon le tableau avec de l&#39;eau bidistillée. Le pH sera ~ 7,3 après 10 min d&#39;aération avec carbogène (95% O 2/5% CO 2), l&#39;osmolarité de 300 mOsm 8. Si une osmolarité supérieure est nécessaire, il peut être ajustée en ajoutant plus de glucose (1 mM est égal à 1 mOsm). La solution est filtrée deux fois en utilisant un filtre à membrane de 0,2 um pour éliminer les p...

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	<li>Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+the+translocation+of+protein+kinase+Calpha-green+fluorescent+protein+hybrids+and+intracellular+calcium+concentrations.">Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations.</a> Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).</li><li>Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorescent+Ca2++dyes+with+green+fluorescent+protein+and+its+variants:+problems+and+solutions.">Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions.</a> Biochem. J. 356, 345-352 (2001).</li><li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides.">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li><li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+GnRH+receptor+neurons:+a+new+model+for+studying+neural+circuits+underlying+reproductive+physiology+in+the+mouse+brain.">Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain.</a> Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).</li><li>Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas.">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li><li>Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+internalization+and+surface+expression+of+a+functional,+fluorescently+tagged+G-protein-coupled+glutamate+receptor.">Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor.</a> Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).</li><li>Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fura+red+as+an+intracellular+calcium+indicator+in+frog+skeletal+muscle+fibers.">Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers.</a> Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).</li><li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotropin-releasing+hormone+modifies+action+potential+generation+in+sheep+pars+distalis+gonadotropes.">Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).</li><li>Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+noninvasive+intracellular+pH+indicator.">Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator.</a> Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).</li><li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+genetically+labeled+gonadotropes.">Functional characterization of genetically labeled gonadotropes.</a> Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).</li><li>Paxinos, G., Franklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pheromones+to+behavior.">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li><li>Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+regulation+of+the+sexual+behavior+and+reproductive+physiology+of+the+laboratory+mouse:+effects+and+neural+mechanisms.">Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms.</a> ILAR J. 50, 28-42 (2009).</li><li>Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+inputs+to+hypothalamic+neurons+controlling+reproduction+and+fertility.">Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility.</a> Cell. 123, 669-682 (2005).</li><li>Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+loops+link+odor+and+pheromone+signaling+with+reproduction.">Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction.</a> Cell. 123, 683-695 (2005).</li><li>Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+network+activity+in+XFP-expressing+neurons+in+the+mouse.">Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).</li><li>Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+near-atmospheric+concentrations+of+CO2+by+an+olfactory+subsystem+in+the+mouse.">Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse.</a> Science. 317, 953-957 (2007).</li><li>Perez, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells.">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).</li><li>Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loading+of+Rhod+2+into+mitochondria+shows+mitochondrial+Ca2++transients+during+the+contractile+cycle+in+adult+rabbit+cardiac+myocytes.">Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).</li><li>Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+Asante+Calcium+Red+-+a+novel+ratiometric+indicator+with+long+excitation+wavelength.">Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength.</a> , (2010).</li></ol>

Une question majeure en neurosciences est de comprendre comment le cerveau traite l&#39;information sociale. Une source prédominante de l&#39;information nécessaire à la reconnaissance sociale est codé par des signaux olfactifs ou phéromones. La détection de ces signaux par des populations neuronales dans le nez et la reconnaissance des signaux dans le cerveau, en particulier l&#39;hypothalamus, jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus sociaux et les hormones influencent et d&#39;autres facteurs neuroe...

There was a typo in the abstract of <a href="http://www.jove.com/video/4213">Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices</a>.

Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Cat. N ° </td></tr><tr><td> Gélose </td><td> Sigma </td><td> A1296 </td></tr><tr><td> Fura-red/AM </td><td> Invitrogen </td><td> F-3021 </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td></tr><tr><td> Le diméthylsulfoxyde </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP231 </td></tr><tr><td> Vibrante de la lame de microtome Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9770170 </td></tr><tr><td> Dispositif de refroidissement CU 65 pour Microtome Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9920120 </td></tr><tr><td> O 2 / CO 2 incubateur, CB210-UL </td><td> Liant </td><td> 0019389 </td></tr><tr><td> Super colle, Loctite 406TM </td><td> Henckel </td><td> 142580 </td></tr><tr><td> Spatules doubles, forme cuillère </td><td>Bochem </td><td> 3182 </td></tr><tr><td> Spatules Microspoon, forme cuillère </td><td> Bochem </td><td> 3344 </td></tr><tr><td> Ciseaux Spring, Moria Vannas-Wolff - Lames 7mm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15370-52 </td></tr><tr><td> Ciseaux Spring, Vannas - Lames 3mm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15000-00 </td></tr><tr><td> Ciseaux Wagner </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14071-12 </td></tr><tr><td> Pince médicale, 7b Dumont </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11270-20 </td></tr><tr><td> Grande Chambre rectangulaire Open Bath (RC-27) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0238 </td></tr><tr><td> Confocale Radiance BioRad Microscope 2100 </td><td> Zeiss </td><td> na </td></tr></tbody></table>

imaging calcium responses in gfp-tagged neurons of hypothalamic mouse brain slices

Malgré une augmentation considérable de nos connaissances sur les mécanismes qui sous-tendent l&#39;encodage de l&#39;information dans le cerveau, une question centrale concernant les mesures précises moléculaires ainsi que l&#39;activité des neurones spécifiques dans multi-fonctionnel des noyaux de zones du cerveau comme l&#39;hypothalamus reste. Ce problème comprend l&#39;identification des composants moléculaires impliqués dans la régulation des cascades de transduction du signal neurohormone différentes. Des élévations des intracellulaire de Ca 2 + jouent un rôle important dans la régulation de la sensibilité des neurones, tant au niveau de la transduction du signal et sur ​​les sites synaptiques. De nouveaux outils ont vu le jour pour aider à identifier les neurones dans la myriade de neurones du cerveau en exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle d&#39;un promoteur particulier. Pour surveiller à la fois spatialement et temporellement stimulus induit par Ca 2 + dans les réponses des neurones marqués GFP, un non-fluorescente verte Ca 2 + colorant indicateur needs à être utilisé. En outre, la microscopie confocale est une méthode préférée de neurones individuels d&#39;imagerie dans des tranches de tissu en raison de sa capacité de visualiser des neurones dans des plans distincts de profondeur dans le tissu et pour limiter l&#39;extérieur de la mise au point de fluorescence. La ratiométrique Ca 2 + indicateur fura-2 a été utilisée en combinaison avec GFP-1 marqué neurones. Toutefois, le colorant est excité par le rayonnement ultraviolet (UV). Le coût du laser et de la profondeur de pénétration limitée optique de la lumière UV empêché son utilisation dans de nombreux laboratoires. En outre, fluorescence de la GFP peut interférer avec les signaux de fura-2 2. Par conséquent, nous avons décidé d&#39;utiliser un rouge fluorescent Ca 2 + colorant indicateur. L&#39;énorme changement Strokes de fura-rouge permet une analyse de la fluorescence multicolore rouge en combinaison avec la GFP en utilisant une longueur d&#39;onde d&#39;excitation unique. Nous avons eu de bons résultats précédemment en utilisant le fura-rouge en combinaison avec GFP-étiqueté neurones olfactifs 3. Les protocoles de tranches de tissus olfactifs semble fonctionner eQually bien dans les neurones hypothalamiques 4. Fura-rouge à base de Ca 2 + imagerie a également réussi à combiner avec pancréatiques GFP-β-cellules marqués et étiquetés GFP-récepteurs exprimés dans des cellules HEK 5,6. Une petite bizarrerie de fura-rouge, c&#39;est que son intensité de fluorescence à 650 nm diminue une fois l&#39;indicateur fixe le calcium 7. Par conséquent, la fluorescence des neurones au repos avec une faible concentration de Ca 2 + a une intensité relativement élevée. Il est à noter, que les autres rouges Ca 2 + indicateurs de colorants existent ou sont en cours d&#39;élaboration, qui pourraient donner de meilleurs résultats ou améliorés dans les neurones du cerveau et de régions différentes.

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Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Dans ce protocole, nous mettons à jour les progrès récents de l&#39;imagerie Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaux des neurones GFP-marqués dans les tranches de tissus du cerveau en utilisant un rouge fluorescent Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indicateur de colorant.

Les réponses de calcium dans les neurones d&#39;imagerie GFP-marqués de hypothalamiques tranches de cerveau de souris

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Double Recordings somatiques de la gonadolibérine (GnRH) neurones identifiés par Green Fluorescent Protein (GFP) en tranches hypothalamiques

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