Name: imaging calcium responses in gfp-tagged neurons of hypothalamic mouse brain slices
Uploaded: 2012-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices at JoVE.com

Vi takker våre kolleger som deltok i arbeidet oppsummert her. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), DFG Schwerpunktprogramm 1392 &#39;Integrative analyse av luktesans&#39; og av Volkswagen Foundation (TLZ). TLZ er en Lichtenberg professor i Volkswagen Foundation.

1. Utarbeidelse av løsning og agarosegel <ol><li> Forbered ekstracellulære løsningen ifølge tabellen med dobbelt-destillert vann. PH vil være ~ 7,3 etter 10 min lufting med CARBOGEN (95% O 2/5% CO2), osmolariteten 300 8 mOsm. Hvis en høyere osmolaritet er nødvendig, kan den justeres ved å tilsette mer glukose (1 mM tilsvarer 1 mOsm). Oppløsningen filtreres to ganger ved hjelp av et 0,2 um membranfilter for å eliminere støvpartikler og mulige bakterielle forurensninger. </li></ol><table...

<ol>
	<li>Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+the+translocation+of+protein+kinase+Calpha-green+fluorescent+protein+hybrids+and+intracellular+calcium+concentrations.">Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations.</a> Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).</li><li>Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorescent+Ca2++dyes+with+green+fluorescent+protein+and+its+variants:+problems+and+solutions.">Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions.</a> Biochem. J. 356, 345-352 (2001).</li><li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides.">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li><li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+GnRH+receptor+neurons:+a+new+model+for+studying+neural+circuits+underlying+reproductive+physiology+in+the+mouse+brain.">Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain.</a> Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).</li><li>Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas.">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li><li>Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+internalization+and+surface+expression+of+a+functional,+fluorescently+tagged+G-protein-coupled+glutamate+receptor.">Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor.</a> Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).</li><li>Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fura+red+as+an+intracellular+calcium+indicator+in+frog+skeletal+muscle+fibers.">Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers.</a> Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).</li><li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotropin-releasing+hormone+modifies+action+potential+generation+in+sheep+pars+distalis+gonadotropes.">Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).</li><li>Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+noninvasive+intracellular+pH+indicator.">Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator.</a> Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).</li><li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+genetically+labeled+gonadotropes.">Functional characterization of genetically labeled gonadotropes.</a> Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).</li><li>Paxinos, G., Franklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pheromones+to+behavior.">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li><li>Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+regulation+of+the+sexual+behavior+and+reproductive+physiology+of+the+laboratory+mouse:+effects+and+neural+mechanisms.">Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms.</a> ILAR J. 50, 28-42 (2009).</li><li>Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+inputs+to+hypothalamic+neurons+controlling+reproduction+and+fertility.">Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility.</a> Cell. 123, 669-682 (2005).</li><li>Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+loops+link+odor+and+pheromone+signaling+with+reproduction.">Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction.</a> Cell. 123, 683-695 (2005).</li><li>Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+network+activity+in+XFP-expressing+neurons+in+the+mouse.">Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).</li><li>Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+near-atmospheric+concentrations+of+CO2+by+an+olfactory+subsystem+in+the+mouse.">Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse.</a> Science. 317, 953-957 (2007).</li><li>Perez, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells.">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).</li><li>Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loading+of+Rhod+2+into+mitochondria+shows+mitochondrial+Ca2++transients+during+the+contractile+cycle+in+adult+rabbit+cardiac+myocytes.">Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).</li><li>Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+Asante+Calcium+Red+-+a+novel+ratiometric+indicator+with+long+excitation+wavelength.">Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength.</a> , (2010).</li></ol>

En viktig spørsmål i nevrovitenskap er å forstå hvordan hjernen behandler sosial informasjon. En dominerende kilden til informasjon som er nødvendig for sosial anerkjennelse er kodet av olfactory eller Pheromonal signaler. Påvisning av disse signalene ved nevronale populasjoner i nesen og anerkjennelse av signalene i hjernen, spesielt hypotalamus, spille en viktig rolle i mange sosiale prosesser og påvirke hormoner og andre neuroendokrine faktorer 13-16. En vesentlig hindring for å analysere neuronal ...

There was a typo in the abstract of <a href="http://www.jove.com/video/4213">Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices</a>.

Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn </td><td> Selskapet </td><td> Kat. N ° </td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma </td><td> A1296 </td></tr><tr><td> Fura-red/AM </td><td> Invitrogen </td><td> F-3021 </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td></tr><tr><td> Dimetylsulfoksid </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP231 </td></tr><tr><td> Vibrerende-Blade mikrotom Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9770170 </td></tr><tr><td> Kjøling enhet CU 65 for mikrotom Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9920120 </td></tr><tr><td> O 2 / CO 2 Inkubator, CB210-UL </td><td> Binder </td><td> 0019389 </td></tr><tr><td> Superlim, Loctite 406TM </td><td> Henckel </td><td> 142580 </td></tr><tr><td> Doble spatler, skje form </td><td>Bochem </td><td> 3182 </td></tr><tr><td> Microspoon spatulas, skje form </td><td> Bochem </td><td> 3344 </td></tr><tr><td> Våren Saks, Moria-Vännäs-Wolff - 7mm Blades </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 15370-52 </td></tr><tr><td> Våren Saks, Vännäs - 3mm Blades </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 15000-00 </td></tr><tr><td> Wagner saks </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 14071-12 </td></tr><tr><td> Medisinsk Forceps, Dumont 7b </td><td> Fin Science Verktøy </td><td> 11270-20 </td></tr><tr><td> Stor Rektangulær Åpen Bath Chamber (RC-27) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0238 </td></tr><tr><td> Confocal mikroskop BioRad Radiance 2100 </td><td> Zeiss </td><td> na </td></tr></tbody></table>

imaging calcium responses in gfp-tagged neurons of hypothalamic mouse brain slices

Til tross for en enorm økning i kunnskap om mekanismene bak koding av informasjon i hjernen, en sentral spørsmål om de nøyaktige molekylære trinn samt aktivitet av spesifikke nerveceller i multi-funksjonelle kjerner av hjernen områder som hypothalamus forbli. Dette problemet omfatter identifikasjon av de molekylære komponentene som er involvert i reguleringen av ulike neurohormone signaltransduksjon kaskader. Forhøyninger av intracellulært Ca2 + spille en viktig rolle i regulering av følsomheten av nevroner, både på nivået av signaltransduksjon og på synaptiske områder. Nye verktøy har kommet for å hjelpe med å identifisere nevroner i mylderet av hjernen neurons ved å uttrykke grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av en bestemt promoter. Å overvåke både romlig og tidsmessig stimulus-indusert Ca 2 + svar i GFP-merkede nevroner, en non-grønn fluorescerende Ca 2 + indikator dye needs skal brukes. I tillegg er konfokalmikroskopi en favoritt fremgangsmåte for avbildning individuelle nevroner i vev skiver på grunn av sin evne til å visualisere nevroner i distinkte plan av dybde i vevet, og å begrense ut-av-fokus fluorescens. Den Proporsjonal Ca 2 + indikator fura-2 har vært brukt i kombinasjon med GFP-merket nevroner 1. Imidlertid er fargestoffet opphisset av ultrafiolett (UV) lys. Kostnaden av laseren og den begrensede optiske inntrengningsdybde av UV-lys hindret bruken i mange laboratorier. Videre kan GFP fluorescens forstyrre fura-2 signaler 2. Derfor har vi besluttet å bruke en rød fluorescerende Ca 2 + indikator fargestoff. Den enorme Strokes forskyvning av fura-rød tillater flerfarget analyse av rød fluorescens i kombinasjon med GFP hjelp av en enkelt eksitasjonsbølgelengde. Vi hadde tidligere gode resultater ved bruk av fura-rød i kombinasjon med GFP-merket olfactory neurons 3. Protokollene for olfactory vev skiver syntes å fungere equally godt i hypothalamus nevroner 4. Fura-red basert Ca 2 + bildebehandling ble også vellykket kombinert med GFP-merket bukspyttkjertelen β-celler og GFP-merket reseptorer uttrykt i HEK celler 5,6. Litt innfall av fura-rødt er at dens fluorescens intensitet ved 650 nm avtar når indikatorlampen binder kalsium 7. Derfor har fluorescens av hvilende nevroner med lav Ca2 + konsentrasjon relativt høy intensitet. Det bør bemerkes at andre røde Ca 2 +-indikatoren fargestoffer eksisterer eller er under utvikling, som kan gi bedre eller forbedret resultat i ulike nerveceller og hjernen områder.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices at JoVE.com

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

I denne protokollen, oppdaterer vi siste utviklingen i bildebehandling Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signalene GFP-merket nevroner i hjernen vev skiver med en rød fluorescerende Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indikator fargestoff.

Bildebehandling Kalsium Responses i GFP-merket Neurons av hypothalamus mus hjernen Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Kalsium Imaging av lukt-evoked Responses i Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Utarbeidelse av Akutt subventricular sone Slices for kalsium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation og Time-lapse Imaging av neuroblast Migration in Mouse Akutt Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

To-fotonet kalsium Imaging i Neuronal Dendrites i hjernen skiver

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric kalsium avbilding av individuelle Neurons i oppfører seg Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Kalsium Imaging for å visualisere hjernen Svar å endokrine signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Ballistisk merking av pyramidale nevroner i hjerneskiver og i primær cellekultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo kalsiumavbildning av mus Geniculate Ganglion Neuron Responser på smak stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Kalsiumavbildning i musen dårligere oliven

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...