Name: imaging calcium responses in gfp-tagged neurons of hypothalamic mouse brain slices
Uploaded: 2012-08-24T13:00:00
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Agradecemos a nuestros colegas que participaron en el trabajo resumido aquí. Este trabajo fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), «Análisis Integral del olfato &#39;la DFG Schwerpunktprogramm 1392 y por la Fundación Volkswagen (TLZ). TLZ es profesor Lichtenberg de la Fundación Volkswagen.

1. Preparación de la solución y gel de agarosa <ol><li> Preparar la solución extracelular de acuerdo con la tabla con agua doblemente destilada. El pH se ~ 7,3 después de 10 minutos de aireación con carbógeno (95% O 2/5% CO 2), la osmolaridad de 300 mOsm 8. Si una osmolaridad superior se requiere, se puede ajustar mediante la adición de más glucosa (1 mm es igual a 1 mOsm). La solución se filtró dos veces usando un filtro de 0,2 micras membrana para eliminar partículas de po...

<ol>
	<li>Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+the+translocation+of+protein+kinase+Calpha-green+fluorescent+protein+hybrids+and+intracellular+calcium+concentrations.">Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations.</a> Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).</li><li>Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorescent+Ca2++dyes+with+green+fluorescent+protein+and+its+variants:+problems+and+solutions.">Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions.</a> Biochem. J. 356, 345-352 (2001).</li><li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides.">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li><li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+GnRH+receptor+neurons:+a+new+model+for+studying+neural+circuits+underlying+reproductive+physiology+in+the+mouse+brain.">Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain.</a> Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).</li><li>Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas.">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li><li>Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+internalization+and+surface+expression+of+a+functional,+fluorescently+tagged+G-protein-coupled+glutamate+receptor.">Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor.</a> Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).</li><li>Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fura+red+as+an+intracellular+calcium+indicator+in+frog+skeletal+muscle+fibers.">Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers.</a> Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).</li><li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotropin-releasing+hormone+modifies+action+potential+generation+in+sheep+pars+distalis+gonadotropes.">Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).</li><li>Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+noninvasive+intracellular+pH+indicator.">Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator.</a> Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).</li><li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+genetically+labeled+gonadotropes.">Functional characterization of genetically labeled gonadotropes.</a> Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).</li><li>Paxinos, G., Franklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pheromones+to+behavior.">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li><li>Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+regulation+of+the+sexual+behavior+and+reproductive+physiology+of+the+laboratory+mouse:+effects+and+neural+mechanisms.">Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms.</a> ILAR J. 50, 28-42 (2009).</li><li>Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+inputs+to+hypothalamic+neurons+controlling+reproduction+and+fertility.">Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility.</a> Cell. 123, 669-682 (2005).</li><li>Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+loops+link+odor+and+pheromone+signaling+with+reproduction.">Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction.</a> Cell. 123, 683-695 (2005).</li><li>Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+network+activity+in+XFP-expressing+neurons+in+the+mouse.">Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).</li><li>Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+near-atmospheric+concentrations+of+CO2+by+an+olfactory+subsystem+in+the+mouse.">Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse.</a> Science. 317, 953-957 (2007).</li><li>Perez, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells.">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).</li><li>Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loading+of+Rhod+2+into+mitochondria+shows+mitochondrial+Ca2++transients+during+the+contractile+cycle+in+adult+rabbit+cardiac+myocytes.">Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).</li><li>Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+Asante+Calcium+Red+-+a+novel+ratiometric+indicator+with+long+excitation+wavelength.">Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength.</a> , (2010).</li></ol>

Una cuestión importante de la neurociencia es comprender cómo el cerebro procesa la información social. Una fuente principal de información necesaria para el reconocimiento social está codificada mediante señales olfatorias o feromonas. La detección de estas señales por poblaciones neuronales en la nariz y el reconocimiento de las señales en el cerebro, especialmente el hipotálamo, juegan un papel clave en muchos procesos sociales y hormonas y otros factores de influencia neuroendocrinos 13-16. Un o...

There was a typo in the abstract of <a href="http://www.jove.com/video/4213">Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices</a>.

Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Cat. N ° </td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma </td><td> A1296 </td></tr><tr><td> Fura-red/AM </td><td> Invitrogen </td><td> F-3021 </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP231 </td></tr><tr><td> Vibrante-Blade Micrótomo Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9770170 </td></tr><tr><td> Dispositivo de enfriamiento CU 65 para Micrótomo Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9920120 </td></tr><tr><td> O 2 / CO 2 incubadora, CB210-UL </td><td> Carpeta </td><td> 0019389 </td></tr><tr><td> Super Glue, Loctite 406TM </td><td> Henckel </td><td> 142580 </td></tr><tr><td> Espátulas dobles, forma de cuchara </td><td>Bochem </td><td> 3182 </td></tr><tr><td> Espátulas, forma cuchara Microspoon </td><td> Bochem </td><td> 3344 </td></tr><tr><td> Tijeras de primavera, Moria-Vannas-Wolff - Hojas 7mm </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 15370-52 </td></tr><tr><td> Tijeras Vannas - Primavera, Hojas 3mm </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 15000-00 </td></tr><tr><td> Tijeras Wagner </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 14071-12 </td></tr><tr><td> Medical Forceps, 7b Dumont </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11270-20 </td></tr><tr><td> Gran cámara rectangular Open Bath (RC-27) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0238 </td></tr><tr><td> Microscopio Confocal Resplandor BioRad 2100 </td><td> Zeiss </td><td> na </td></tr></tbody></table>

imaging calcium responses in gfp-tagged neurons of hypothalamic mouse brain slices

A pesar de un aumento enorme en nuestro conocimiento sobre los mecanismos subyacentes a la codificación de la información en el cerebro, una cuestión fundamental en relación con los pasos precisos molecular, así como la actividad de neuronas específicas en multi-funcional núcleos de áreas del cerebro tales como el hipotálamo permanecer. Este problema se incluye la identificación de los componentes moleculares implicados en la regulación de diversas neurohormonas cascadas de transducción de señales. Las elevaciones de Ca 2 + intracelular desempeñan un papel importante en la regulación de la sensibilidad de las neuronas, tanto en el nivel de transducción de señales y en los sitios sinápticos. Han surgido nuevas herramientas para ayudar a identificar las neuronas en la miríada de neuronas cerebrales mediante la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de un promotor particular. Para supervisar tanto espacial como temporalmente estímulo inducido por Ca 2 + respuestas en GFP-etiquetados neuronas, un no-verde fluorescente Ca 2 + colorante indicador nEEDS para ser utilizado. Además, la microscopía confocal es un método preferido de formación de imágenes de las neuronas individuales en rodajas de tejido debido a su capacidad para visualizar las neuronas en distintos planos de profundidad dentro del tejido y para limitar fuera de foco de fluorescencia. El ratiométrica Ca 2 + indicador fura-2 se ha utilizado en combinación con GFP-etiquetados neuronas 1. Sin embargo, el colorante es excitado por la luz ultravioleta (UV). El coste del láser y la limitada profundidad de penetración óptica de la luz UV impedido su uso en muchos laboratorios. Además, la fluorescencia de GFP puede interferir con las señales de fura-2 2. Por lo tanto, se decidió utilizar un color rojo fluorescente Ca 2 + colorante indicador. El cambio Strokes enorme de fura-rojo multicolor permite el análisis de la fluorescencia de color rojo en combinación con GFP usando una longitud de onda de excitación única. Hemos tenido resultados buenos previamente utilizando fura-rojo en combinación con GFP-etiquetados neuronas olfativas 3. Los protocolos para cortes de tejido olfativo parecía funcionar equally bien en las neuronas hipotalámicas 4. Fura-red basada Ca 2 + de imágenes también fue combinado con éxito con GFP-etiquetados β pancreáticas y células GFP-etiquetados receptores expresados ​​en células HEK 5,6. Una peculiaridad de fura-red es que la intensidad de fluorescencia a 650 nm disminuye una vez que el indicador se une al calcio 7. Por lo tanto, la fluorescencia de las neuronas en reposo con baja concentración de Ca 2 + tiene una intensidad relativamente alta. Cabe señalar, que los otros rojos Ca 2 +-indicador tintes existen o se están desarrollando, que podría dar mejores resultados o mejores en las neuronas y áreas diferentes del cerebro.

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Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

En este protocolo, actualizamos los recientes avances en imágenes Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Señales de neuronas GFP-etiquetados en cortes de tejido cerebral con un rojo fluorescente Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indicador de tinte.

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

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Las grabaciones de doble somáticas de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) identificados por la proteína verde fluorescente (GFP) en cortes de hipotálamo

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Investigación

Neurociencias

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

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El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

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Preparación de agudos Slices zona subventricular for Imaging Calcio

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

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The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

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It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

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Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila

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Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Etiquetado balístico de las neuronas piramidales en las rebanadas cerebrales y en el cultivo celular primario

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Imágenes de calcio in vivo de las respuestas de las neuronas ganglionares geniculadas de ratón a los estímulos del gusto

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

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In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

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