Name: imaging calcium responses in gfp-tagged neurons of hypothalamic mouse brain slices
Uploaded: 2012-08-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices at JoVE.com

Vi tackar våra kolleger som deltagit i arbetet sammanfattas här. Detta arbete har finansierats med bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), DFG Schwerpunktprogramm 1392 &quot;Integrativ analys av luktsystemet&quot; och av Volkswagen Foundation (TLZ). TLZ är en Lichtenberg professor i Volkswagen-stiftelsen.

1. Framställning av lösning och agarosgel <ol><li> Framställ extracellulära lösningen enligt tabellen med dubbeldestillerat vatten. PH kommer att vara ~ 7,3 efter 10 min luftning med karbogen (95% O 2/5% CO 2), osmolariteten 300 mOsm 8. Om en högre osmolaritet erfordras, kan den justeras genom tillsats av mer glukos (1 mM motsvarar 1 mOsm). Lösningen filtreras två gånger med en 0,2-filter im membran för att eliminera damm och eventuella bakteriella föroreningar. </li></ol><t...

<ol>
	<li>Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+the+translocation+of+protein+kinase+Calpha-green+fluorescent+protein+hybrids+and+intracellular+calcium+concentrations.">Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations.</a> Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).</li><li>Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorescent+Ca2++dyes+with+green+fluorescent+protein+and+its+variants:+problems+and+solutions.">Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions.</a> Biochem. J. 356, 345-352 (2001).</li><li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides.">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li><li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+GnRH+receptor+neurons:+a+new+model+for+studying+neural+circuits+underlying+reproductive+physiology+in+the+mouse+brain.">Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain.</a> Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).</li><li>Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas.">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li><li>Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+internalization+and+surface+expression+of+a+functional,+fluorescently+tagged+G-protein-coupled+glutamate+receptor.">Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor.</a> Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).</li><li>Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fura+red+as+an+intracellular+calcium+indicator+in+frog+skeletal+muscle+fibers.">Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers.</a> Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).</li><li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotropin-releasing+hormone+modifies+action+potential+generation+in+sheep+pars+distalis+gonadotropes.">Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).</li><li>Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+noninvasive+intracellular+pH+indicator.">Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator.</a> Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).</li><li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+genetically+labeled+gonadotropes.">Functional characterization of genetically labeled gonadotropes.</a> Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).</li><li>Paxinos, G., Franklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pheromones+to+behavior.">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li><li>Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+regulation+of+the+sexual+behavior+and+reproductive+physiology+of+the+laboratory+mouse:+effects+and+neural+mechanisms.">Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms.</a> ILAR J. 50, 28-42 (2009).</li><li>Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+inputs+to+hypothalamic+neurons+controlling+reproduction+and+fertility.">Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility.</a> Cell. 123, 669-682 (2005).</li><li>Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+loops+link+odor+and+pheromone+signaling+with+reproduction.">Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction.</a> Cell. 123, 683-695 (2005).</li><li>Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+network+activity+in+XFP-expressing+neurons+in+the+mouse.">Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).</li><li>Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+near-atmospheric+concentrations+of+CO2+by+an+olfactory+subsystem+in+the+mouse.">Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse.</a> Science. 317, 953-957 (2007).</li><li>Perez, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells.">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).</li><li>Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loading+of+Rhod+2+into+mitochondria+shows+mitochondrial+Ca2++transients+during+the+contractile+cycle+in+adult+rabbit+cardiac+myocytes.">Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).</li><li>Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+Asante+Calcium+Red+-+a+novel+ratiometric+indicator+with+long+excitation+wavelength.">Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength.</a> , (2010).</li></ol>

En stor fråga inom neurovetenskap är att förstå hur hjärnan bearbetar social information. En dominerande källa till information som är nödvändig för socialt erkännande kodas av lukt eller feromonal signaler. Detektering av dessa signaler genom neuronala populationer i näsan och erkännande av signalerna i hjärnan, särskilt hypotalamus, spelar en viktig roll i många sociala processer och hormoner inflytande och andra neuroendokrina faktorer 13-16. En väsentlig hinder att analysera neuronala sva...

There was a typo in the abstract of <a href="http://www.jove.com/video/4213">Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices</a>.

Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn </td><td> Företag </td><td> Kat. N ° </td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma </td><td> A1296 </td></tr><tr><td> Fura-red/AM </td><td> Invitrogen </td><td> F-3021 </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td></tr><tr><td> Dimetylsulfoxid </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP231 </td></tr><tr><td> Vibrerande-Blade Mikrotom Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9770170 </td></tr><tr><td> Avkylningsanordning CU 65 för Mikrotom Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9920120 </td></tr><tr><td> O 2 / CO 2 inkubator, CB210-UL </td><td> Bindemedel </td><td> 0019389 </td></tr><tr><td> Superlim, Loctite 406TM </td><td> Henckel </td><td> 142.580 </td></tr><tr><td> Dubbla spatlar, sked form </td><td>Bochem </td><td> 3182 </td></tr><tr><td> Microspoon spatlar, sked form </td><td> Bochem </td><td> 3344 </td></tr><tr><td> Spring Saxar, Moria-Vännäs-Wolff - 7mm Blades </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.370-52 </td></tr><tr><td> Spring Saxar, Vännäs - 3mm blad </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.000-00 </td></tr><tr><td> Wagner Sax </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14.071-12 </td></tr><tr><td> Medicinsk Tång, Dumont 7b </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.270-20 </td></tr><tr><td> Stor rektangulär Open Bath Chamber (RC-27) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0238 </td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop BioRad Radiance 2100 </td><td> Zeiss </td><td> na </td></tr></tbody></table>

imaging calcium responses in gfp-tagged neurons of hypothalamic mouse brain slices

Trots en enorm ökning av vår kunskap om de mekanismer som ligger bakom kodningen av information i hjärnan, en central fråga om de exakta molekylära stegen samt aktiviteten av specifika nervceller i multifunktionella kärnor av områden i hjärnan som hypotalamus kvar. Detta problem finns identifiering av de molekylära komponenterna involverade i regleringen av olika transduktion neurohormon signal kaskader. Förhöjda intracellulära Ca 2 + spelar en viktig roll vid reglering av känsligheten av neuroner, såväl på nivån för signaltransduktion och vid synaptiska ställen. Nya verktyg har skapats för att hjälpa till att identifiera neuroner i den myriad av hjärnans nervceller genom att uttrycka grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av en viss promotor. Att övervaka både rumsligt och tidsmässigt stimulus-inducerad Ca 2 + svar i GFP-märkta neuroner, en icke-grönt fluorescerande Ca 2 + indikatorfärgämne nEEDS användas. Dessutom, är konfokalmikroskopi en favorit metod för avbildning enskilda neuroner i vävnadsskivor grund av dess förmåga att visualisera neuroner i distinkta plan djupet i vävnaden och begränsa utanför fokus fluorescens. Den kvotmetriska Ca 2 + indikator fura-2 har använts i kombination med GFP-märkt neuroner 1. Emellertid färgämnet exciteras av ultraviolett (UV) ljus. Kostnaden för lasern och den begränsade optiska inträngningsdjupet för UV-ljus hindrat dess användning i många laboratorier. Vidare kan GFP-fluorescens interferera med fura-2 signalerna 2. Därför bestämde vi oss för att använda en röd fluorescerande Ca 2 + indikatorfärgämne. Den enorma Strokes förskjutning av fura-röd tillåter multicolor analys av röd fluorescens i kombination med GFP med en enda excitationsvåglängd. Vi hade tidigare goda resultat med fura-röd i kombination med GFP-märkta lukt neuroner 3. Protokollen för lukt vävnad skivor verkade fungera equally väl i hypotalamus neuroner 4. Fura-röd baserade Ca 2 + imaging har också framgångsrikt kombinerat med GFP-märkta pankreas β-celler och GFP-märkta receptorer som uttrycks i HEK celler 5,6. En liten sarkasm i fura-röd är att dess fluorescensintensitet vid 650 nm minskar när indikatorn binder kalcium 7. Därför har fluorescensen av vilande neuroner med lågt Ca 2 + koncentrationen relativt hög intensitet. Det bör noteras, att andra röda Ca 2 +-indikatorfärgämnen finns eller håller på att utvecklas, kan det ge bättre eller förbättrade resultat i olika nervceller och områden i hjärnan.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices at JoVE.com

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

I detta protokoll uppdaterar vi senaste framstegen i bildbehandling Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaler av GFP-märkta neuroner i skivor hjärnvävnad med en röd fluorescerande Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indikatorfärgämnet.

Imaging Kalcium svar i GFP-märkta neuroner i hypotalamus skivor mushjärna

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Dubbla Somatisk Inspelningar från gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) Nervceller Märkt med grönt fluorescerande protein (GFP) i hypotalamus Slices

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Kalcium avbildning av Lukt framkallade svar i Drosophila Antenn lob

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Beredning av akut subventrikulära zonen Skivor för kalcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal elektroporation och Time-lapse avbildning av neuroblast migration i mus Akut hjärnan skivor

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Två-foton kalcium Imaging i nervcellernas dendriter i hjärnan skivor

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Proportionerlig kalcium avbildning av enskilda nervceller i beter sig Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Kalcium Imaging för att visualisera hjärnan Svaren till endokrin signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Ballistisk märkning av pyramidal neuroner i hjärnan skivor och i primär cell kultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo kalciumavbildning av mus geniculate ganglion neuron svar på smak stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Kalciumavbildning i mus underlägsen oliv

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...