Name: cell specific analysis of arabidopsis leaves using fluorescence activated cell sorting
Uploaded: 2012-10-04T13:00:00
Duration: 11 min 25 s
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सेल प्रकार और विकास मंच विशिष्ट रूपरेखा पर बुकानन - Wollaston प्रयोगशाला में काम Agron omics 6 वें यूरोपीय आयोग के फ्रेमवर्क प्रोग्राम में परियोजना (अनुदान LSHG सीटी-2006-+०३७७०४) द्वारा समर्थित है. सेल प्रकार विशिष्ट रूपरेखा पर जिफोर्ड प्रयोगशाला में काम करना एक बीबीएसआरसी नई अन्वेषक अनुदान (BB/H019502/1) द्वारा समर्थित है. KC274 और KC464 Arabidopsis लाइनों आर वेब (कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय) से प्राप्त किया गया.

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	<li>Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+Simple+and+Compound+Leaves:+A+Critical+Review.">Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review.</a> Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).</li><li>Kleber, R., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Quality+Assessment+of+RNA+From+Cell-Specific+Samples+Obtained+by+Laser+Microdissection.">Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection.</a> Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).</li><li>Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. 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K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+shoot+apical+meristem+stem+cell+niche.">Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche.</a> PNAS. 106, 4941-4946 (2009).</li><li>Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+photosynthesis-related+gene+fusions+is+restricted+by+cell+type+in+transgenic+plants+and+in+transfected+protoplasts.">Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts.</a> PNAS. 87, 816-820 (1990).</li><li>Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+strong+Arabidopsis+guard+cell+promoter+and+it's+potential+as+a+research+tool.">Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it's potential as a research tool.</a> Plant Methods. 4, 6 (2008).</li><li>Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -. M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+GFP+enhancer+trap+lines+for+analysis+of+stomatal+guard+cell+development+and+gene+expression.">GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression.</a> J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

हम एक तरीका है कि Arabidopsis मूलतत्त्व पीढ़ी और बाद सेल FACS का उपयोग कर छँटाई के लिए पत्तियों में GFP व्यक्त पौधों के उपयोग की अनुमति देता का वर्णन किया है. इस विधि पैदावार शाही सेना के लिए पर्याप्त मात्रा में प्रवर्धन और इसलिए बाद के विश्लेषण के लिए या तो qPCR या माइक्रोएरे द्वारा इस्तेमाल किया जा. क्रमबद्ध fractions अत्यधिक GFP युक्त कोशिकाओं, के रूप में qPCR (2 चित्रा) द्वारा प्रदर्शन के लिए समृद्ध है. रहते मूलतत्त्वों के उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया के प्रारंभिक चरणों के दौरान तेजी से काम करने के लिए महत्वपूर्ण है, जब तक पत्ता स्ट्रिप्स अवरोध करनेवाला युक्त मूलतत्त्व समाधान के साथ घुसपैठ शून्य कर दिया गया है. इसके अलावा, जब 1 मिमी पत्ता स्ट्रिप्स पैदा यह बहुत महत्वपूर्ण है टुकड़ा या पत्तियों के बजाय &#39;काट&#39; या उन्हें मैश कटौती, के रूप में यह अत्यधिक नुकसान और इस तरह एक कम मूलतत्त्व उपज होता है. विधि के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर यहाँ और अन्य publishe वर्णितRNase inhibitors और transcriptional inhibitors के विकास के तरीकों का इस्तेमाल होता है. अधिकांश तरीकों Arabidopsis जड़ों, जिसमें से मूलतत्त्वों अधिक आसानी से उत्पन्न किया जा सकता है के लिए विकसित कर रहे हैं. हालांकि, जब पत्तियों के साथ काम कर, पर्णमध्यक छोड़कर, यह मूलतत्त्व पीढ़ी के समय को बढ़ाने के लिए आवश्यक है. इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि इन inhibitors शामिल मूलतत्त्व पीढ़ी उपचार ही (नहीं दिखाया डेटा) का एक परिणाम के रूप में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के खिलाफ की रक्षा. हालांकि, inhibitors की उपस्थिति एक प्रतिलेखन प्रतिक्रिया माउंट करने में असमर्थता के लिए जाता है, या तो स्विचन पर जीन या बंद, जो मूलतत्त्वों अधिक संवेदनशील बनाने की संभावना है के रूप में इस plasticity की एक नुकसान होता है जिसके साथ के तनावों का मुकाबला करने के लिए प्रक्रिया protoplasting. हम यहाँ GFP-व्यक्त Arabidopsis लाइनों की एक संख्या के साथ सफलतापूर्वक वर्णित विधि का इस्तेमाल किया है. महत्वपूर्ण बात है, हम GFP GFP व्यक्त लाइनों में या तो दृढ़ता के साथ इस विधि का इस्तेमाल किया हैनाभिक, या अधिक दुबला एक non-localized/diffuse साइटोसोलिक तरीके में ज्यादा है, के रूप में KC464 और KC274 यहां इस्तेमाल किया लाइनों के साथ मामला है. लाइनों के दोनों प्रकार के विधि के साथ संगत कर रहे हैं और उपज GFP व्यक्त मूलतत्त्वों के अत्यधिक समृद्ध भागों (2 चित्रा और 3). विधि आसानी से अन्य fluorophores अनुकूलित किया जा सकता है, हालांकि fluorophore प्रतिदीप्ति है कि जीवित कोशिकाओं का चयन करने की क्षमता बनाए रखने के क्रम में मृत / मर कोशिकाओं के autofluorescence से काफी अलग है के लिए चयनित किया जाना चाहिए.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td></tr><tr><td> R-10 Cellulase </td><td> Melford </td><td> C8001 </td></tr><tr><td> Cellulase RS </td><td> Melford </td><td> C8003 </td></tr><tr><td> R-10 Macerozyme </td><td> Melford </td><td> M8002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> A3912 </td></tr><tr><td> ProtectRNA </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> R7397 </td></tr><tr><td> Actinomycin डी </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> A1410 </td></tr><tr><td> 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी </td><td> मछुआ </td><td> FB35181 </td></tr><tr><td> 50 सुक्ष्ममापी फिल्टर कप प्रकार filcon </td><td> बी.डी. बायोसाइंसेज </td><td> 340630 </td></tr></tbody></table>

cell specific analysis of arabidopsis leaves using fluorescence activated cell sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

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Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

उत्पादन के लिए विधि<em&gt; Arabidopsis</em&gt; पत्ता मूलतत्त्वों कि प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के साथ संगत कर रहे हैं, विशेष सेल आबादी के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. इस विधि में किसी के साथ संगत है<em&gt; Arabidopsis</em&gt; लाइन है कि कोशिकाओं के एक सबसेट में GFP व्यक्त.

सेल के विशिष्ट विश्लेषण<em&gt; Arabidopsis</em&gt; प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई का उपयोग पत्ते

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

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ऊतक और अंग विशेष Phytochrome प्रतिक्रियाएँ में FACS की सहायता सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति रूपरेखा का उपयोग की जांच Arabidopsis thaliana</em

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Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

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