Name: cell specific analysis of arabidopsis leaves using fluorescence activated cell sorting
Uploaded: 2012-10-04T13:00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting at JoVE.com

Работа в Бьюкенен-Волластон лаборатории по камерного типа и стадии развития конкретных профилей при поддержке Агрон-омик проекта (грант № LSHG-CT-2006-037704) в 6-й Рамочной Progamme Европейской комиссии. Работа в лаборатории Гиффорд по камерного типа конкретных профилей поддерживается BBSRC новый следователь гранта (BB/H019502/1). KC274 и KC464 Arabidopsis линии были получены из AAR Уэбб (Кембриджский университет).

1. Протопластов поколения <ol><li> Урожай материала листьев и нарезать шириной 1 мм полосы (рис. 1) с лезвием бритвы. Для образцов, содержащих более одного листа до 15 листьев может быть легко сложены перед нарезкой. </li><li> Немедленно передать листа полос, на 9 см круглой чашки Петри, содержащую 20 мл раствора (400 мМ маннит, 20 мМ MES гидрат, 20 мМ KCl, 10 мМ CaCl 2, 2 мМ MgCl 2, 0,1% BSA и 2,5 мМ β-меркаптоэтанол, рН 5,7) в том числе protoplasting ферментов (1,2% целлюлозы R-10, 0,6% целлюлозы RS и 0,4% macerozyme R-10) и РНКазы и транскрипционной ингибиторов (1 × ProtectRNA и 10 мкг / мл актиномицина D); аккуратно отделить листья полосы и вакуум проникают в течение 2 × 5 мин. </li><li> Место чашку Петри на орбитальном шейкере установлена ​​на 90 мин при комнатной температуре и протопластов в течение 3-4 часов. <ol><li> Во время инкубации листьев полоски должны быть отделены друг от друга, путем использованияНабор плоский пинцет, через каждые полчаса. </li></ol></li><li> Поместите 70 мкм ячейки фильтра (Fisher Scientific) в 50 мл трубки и осторожно фильтрации раствора через protoplasting. Это позволит удалить листья полосы, которая будет храниться в сито, позволяя протопластов, чтобы пройти. </li><li> Промойте листья полос с 4 мл раствора и осторожно процедить через сито же. </li><li> Передача протопластов в круглых труб дно и центрифуги протопластов решение при 300 мкг в течение 5 мин для осаждения протопластов. </li><li> Аккуратно аспирации от, как большая часть супернатанта насколько это возможно без нарушения протопластов. </li><li> Вымойте протопластов с 5 мл раствора и центрифуги при 300 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант </li><li> Ресуспендируют протопластов в соответствующий объем раствора с помощью пипетки Пастера или отсечения P1000 чаевых. </li></ol> 2. FACS из листьев Протопласты </p&gt; <ol><li> Непосредственно перед сортировкой, ресуспендируют протопластов использовании (без разреза) P1000 совет, чтобы избежать слипания вместе протопластов. </li><li> Передача протопластов к сортировке трубку, через 50 мкм фильтр filcon (BD Biosciences) и разбавить по мере необходимости, чтобы избежать засорения сопла клетки сортировщика. Протопласты сортируются с использованием 100 мкм сопла при давлении 20 фунтов (оболочка) и 21-21.5 фунтов на квадратный дюйм (образца), частота 39,2 кГц и события скорость &lt;4000 (эти параметры являются оптимальными по мобильному сортировщик приток BD (BD Biosciences). Оптимизация на других машинах сортировки клеток, возможно, потребуется корректировка этих параметров). </li><li> GFP положительных протопластов определены с использованием 488 нм аргонового лазера и построения выходом из 580/30 полосовой фильтр (оранжевый) по сравнению с 530/40 полосовой фильтр (зеленый). GFP положительных протопластов будет в высокой 530/low 580 населения, с не-GFP протопластов в низких 530/580 низком населения и мертвых / умирает протопластов и мусора в высоком 580 населенаселения (рис. 2). <ol><li> При сортировке протопласты, из которых РНК будут извлечены, протопласты должны быть отсортированы непосредственно в меньшей мере, 4 объемов лизис буфера, содержащего восстановитель (например, β-меркаптоэтанол). Кроме того, сорт время одного образца должно быть ограничено 20-30 мин, а максимальный от двух до трех образцов обрабатываются в любой момент времени. </li><li> Для визуализации отсортированы протопластов, протопласты должны быть отсортированы непосредственно в меньшей мере, 8 объемы раствора, а затем собирают центрифугированием сосредоточиться протопластов. </li></ol></li></ol> 3. Представитель Результаты Этот протокол описывает метод получения протопластов из листьев Arabidopsis, которые используются для флуоресценции активирован сортировки клеток (рис. 1). Протопластов поколения в присутствии РНКазы и транскрипционной ингибиторов предотвращает клетки FROM монтажа транскрипционный ответ. Это имеет следствием породив множество мертвых и умирающих протопласты, которые имеют значительный уровень автофлуоресценции. При сортировке протопластов подготовлен с помощью этого метода поэтому очень часто можно увидеть несколько различных популяций в графиках 580 нм против 530 нм флуоресценции используется для сортировки. Примеры этого, вместе с сортировкой ворота, используемые в настоящем протоколе показано на рисунке 3. Протопласты могут быть отсортированы в 8 томах решения и собрали для визуализации проверить обогащения. Рис 2G показан пример использования этой TP382 линии, которая выражает GFP в замыкающих клеток. Примеры выходы, полученные с помощью этого метода, как до, так и после усиления, приведены в таблице 1. Суммы, полученные достаточным для амплификации с использованием Ovation Pico WTA системы (500 PG-50 нг) и, следовательно, сubsequent анализа либо КПЦР (рис. 4), следующая последовательность поколения или микрочипов. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig1.jpg" /> Рисунок 1. Общий рабочий процесс для эксперимента. 1) урожай листьев интерес GFP выражение Arabidopsis линии. 2) быстро разрезать на ~ 1 мм шириной полосы и немедленно передать их в protoplasting решения и вакуумные инфильтрата. 3) инкубируют в течение 3-4 часов. 4) Аккуратно фильтрата протопластов раствор через сито 70 мкм, трансфер в круглое дно трубы и гранул протопластов путем центрифугирования. 5) Непосредственно перед сортировкой, ресуспендируют протопластов и передачи сортировки трубку, через 50 мкм фильтр. 6) Сортировка GFP положительные и отрицательные GFP жизнеспособных протопластов. 7) Протопласты теперь могут быть проанализированы визуально или с использованием таких методов, как КПЦР, следующего поколения секвенирования или микрочипов. Рисунок 2. KC464, KC274 и TP382 линии, используемые в этом исследовании. A) Поперечное сечение KC464 листа показывает GFP выражение в адаксиальной эпидермиса. B) протопластов, полученных от KC464 листьев. C) Поперечное сечение KC274 листа показывает GFP выражение в сосудах. D) протопластов, полученных от KC274 листьев. E) TP382 листа показывает GFP выражение в замыкающих клеток. F) протопластов получены из TP382 листьев. G) Пример обогащения получено FACS из GFP выражение замыкающих клеток в сложном фоне листьев клетки, показывая, содержащих GFP протопластов с высокой 530/low 580 населения протопласты, полученные из TP382 листьев. AF: конфокальной микроскопии изображений; G: флуоресцентный микроскоп изображение. Шкала баров в пределах изображения 50 мкм. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig3.jpg" /><html> Рисунок 3. Типичная приобретение FACS точка участков выходом из 580/30 нм (оранжевый) по сравнению с 530/40 нм (зеленый) полосового фильтра (BD приток клетки сортировщика). Сортировка ворота указаны те, которые обычно используются во время сортировки. A) Dot участок Col-4 листа, полученные протопласты, protoplasted в отсутствие ингибиторов, показывая одну низкую 530/low 580 населения. B) Dot участке от мас Col-4 листа, полученные протопласты, protoplasted в присутствии ингибиторов, показывая сдвиг в 580 флуоресценции из-за стресса и окрашивания ингибиторов. CE) Dot участков из листьев, полученные из протопластов KC74, KC464 и TP382 линий, соответственно, protoplasted в присутствии ингибиторов, показывая GFP содержащих населения в высоком 530/low 580 населения. Проценты от событий в GFP (высокая 530/low 580) населению даны. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig3large.jpg" target="_blank">Нажмите, чтобы увеличить показатель</a> . e_content &quot;FO: Keep-together.within-страница =&quot; Всегда &quot;&gt; <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig4.jpg" /> Рисунок 4. GFP выражение в закрытом представитель фракции населения, как показано на рисунке 3. Два биологических повторяет были получены для каждой фракции типа, усиливается использование Ovation Pico WTA системы и КПЦР использованием GFP-специфических праймеров (табл. 2) Затем был проведен. Значения показали самый высокий (красный), низкий (зеленый) и средние относительные значения. Высокая 580 населения в этом случае разделен на две части, низкий 530/low 580 и высокой 530/low 580, для которого одного биологического повторных была использована таким образом, только одно значение показано на рисунке. ACT2 (At3g18780) был использован в качестве стандарта для всех образцов. Лист: весь лист. Разное: Unsorted протопластов. GFP1: высокая 530/low 580 и Rest1: низкая 530/low 580, GFP2: высокая 530/high 580 и Rest2: низкая 530/high 580, как указано на рисунке 3 и вставки. Результаты проверки оF оптических оценки GFP содержимого ячейки в отсортированном фракций (например, 2G рисунок). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig4large.jpg" target="_blank">Нажмите, чтобы увеличить показатель</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Образец </td><td> Количество листьев </td><td> Количество клеток </td><td> РНК выход (НГ) </td><td> РНК выход (С усилителем; нг) </td></tr><tr><td> Всего листа Всего B листьев </td><td> 1 1 </td><td> - - </td><td> 8001 10525 </td><td> 4623 *** 4572 *** </td></tr><tr><td> Unsorted протопласты Unsorted B протопласты </td><td> 5 5 </td><td> - - </td><td> 2433 2625 </td><td> 1152 *** 3321 *** </td></tr><tr><td> GFP1 Rest1 </td><td> 15 </td><td> 6039 (0.39% *) 55389 (6.40% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 861 489 </td></tr><tr><td> GFP1 B Rest1 B </td><td> 15 </td><td> 10 783 (0,63% *) 57 040 (7,49% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 537 420 </td></tr><tr><td> GFP2 Rest2 </td><td> 15 </td><td> 18 337 (1,49% *) 62 405 (73,49% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 360 411 </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Пробы, взятые использованием FACS и проанализированы с КПЦР чтобы определить, какая фракция содержала живые GFP-экспрессирующих протопластов. Кроме того, в этой таблице является общим выходом РНК в нг до и после усиления с Ovation Pico WTA System (NuGen). GFP1, GFP2, Rest1 и Rest2 фракции, как показано на вставке на рисунке 4. * Процент клеток от общей операции сортировки ячейки в скобках возле числа клеток во фракции. Эти показатели не коррелируют сдруг с другом для каждого образца, как рода FACS работает для фракции &quot;отдых&quot; были остановлены раньше, чем для GFP фракции из-за гораздо большего числа клеток, собранных отдыха. ** 50 нг использоваться как входные данные для реакции амплификации, в соответствии с протоколом производителя. <table border="1"><tbody><tr><td> Грунтовка </td><td> Последовательность </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.fw </td><td> GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.rv </td><td> TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT </td></tr><tr><td> ACT2.fw </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr><tr><td> ACT2.rv </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr></tbody></table> Таблица 2. КПЦР праймеров.

<ol>
	<li>Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+Simple+and+Compound+Leaves:+A+Critical+Review.">Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review.</a> Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).</li><li>Kleber, R., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Quality+Assessment+of+RNA+From+Cell-Specific+Samples+Obtained+by+Laser+Microdissection.">Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection.</a> Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).</li><li>Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gene+Expression+Map+of+the+Arabidopsis+root.">A Gene Expression Map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302, 1956-1960 (2003).</li><li>Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Tissue-+and+Organ-specific+Phytochrome+Responses+using+FACS-assisted+Cell-type+Specific+Expression+Profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. (39), e1925 (2010).</li><li>Beal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Method+For+Gene+Expression+and+Chromatin+Profiling+of+Individual+Cell+Types+Within+a+Tissue.">A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue.</a> Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li><li>Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis.">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> PNAS. 106, 18843-18848 (2009).</li><li>Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+Root+Expression+Patterns+Revealed+in+a+High-Resolution+Spatiotemporal+Expression+Map.">Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map.</a> Science. 318, 801-806 (2007).</li><li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity.">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> PNAS. 105, 803-808 (2008).</li><li>Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+identity+mediates+the+response+of+Arabidopsis+roots+to+abiotic+stress.">Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress.</a> Science. 320, 942-945 (2008).</li><li>Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis.">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li><li>Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+shoot+apical+meristem+stem+cell+niche.">Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche.</a> PNAS. 106, 4941-4946 (2009).</li><li>Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+photosynthesis-related+gene+fusions+is+restricted+by+cell+type+in+transgenic+plants+and+in+transfected+protoplasts.">Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts.</a> PNAS. 87, 816-820 (1990).</li><li>Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+strong+Arabidopsis+guard+cell+promoter+and+it's+potential+as+a+research+tool.">Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it's potential as a research tool.</a> Plant Methods. 4, 6 (2008).</li><li>Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -. M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+GFP+enhancer+trap+lines+for+analysis+of+stomatal+guard+cell+development+and+gene+expression.">GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression.</a> J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы описали метод, который позволяет использовать Arabidopsis растений, экспрессирующих GFP в листьях для генерации протопластов и последующей сортировки клеток с использованием FACS. Этот метод дает достаточного количества РНК, которые будут использоваться для усиления и поэтому последующий анализ либо КПЦР или микрочипов. Фракции отсортированы высоко обогащенные для GFP-содержащие клетки, как показали КПЦР (рис. 2). Для достижения высоких урожаев живой протопластов важно работать быстро в течение первых шагов процедуры, пока листья полосы были вакуум проникли с ингибитором содержащих протопластов решение. Кроме того, при создании 1 полосы мм листа очень важно, чтобы нарезать или вырезать листья, а не «отбивную» или пюре из них, так как это приводит к чрезмерному повреждению и, следовательно, более низкую доходность протопластов. Существенная разница между методом, описанным здесь и другие publisheг методов является использование ингибитора РНКазы и транскрипционной ингибиторов. Большинство методов разработаны для Arabidopsis корней, от которых протопласты могут быть получены более легко. Тем не менее, при работе с листьями, за исключением мезофилла, необходимо увеличить время протопластов поколения. Поэтому важно, чтобы включить эти ингибиторы для защиты от изменения в экспрессии генов в результате лечения протопластов поколение само по себе (данные не представлены). Тем не менее, наличие ингибиторов приводит к невозможности установить транскрипции ответа, либо путем переключения генов или выключить, которая, вероятно, чтобы сделать протопластов более уязвимы, так как это приводит к потере пластичности, с которыми по борьбе с напряжениями protoplasting процедуры. Мы использовали метод, описанный здесь успешно число GFP-экспрессирующих Arabidopsis линий. Важно отметить, что мы использовали этот метод с GFP линий, экспрессирующих GFP либо сильно вядро, или гораздо более слабо в non-localized/diffuse цитозольного образом, как и в случае с KC464 и KC274 линии, используемые здесь. Оба типа линий совместимы с методом и получением обогащенного доли GFP-экспрессирующих протопластов (рис. 2 и 3). Этот метод может быть легко адаптирована к другим флуорофоры, хотя флуорофора должны быть выбраны для флуоресценции, что существенно отличается от аутофлюоресценции мертвых / умирающие клетки для того, чтобы сохранить возможность выбора живых клеток.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td></tr><tr><td> Cellulase R-10 </td><td> Melford </td><td> C8001 </td></tr><tr><td> Cellulase RS </td><td> Melford </td><td> C8003 </td></tr><tr><td> Macerozyme R-10 </td><td> Melford </td><td> M8002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3912 </td></tr><tr><td> ProtectRNA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7397 </td></tr><tr><td> Актиномицин D </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1410 </td></tr><tr><td> 70 мкм ячейки фильтра </td><td> Рыбак </td><td> FB35181 </td></tr><tr><td> 50 мкм filcon чашки типа фильтров </td><td> BD Biosciences </td><td> 340630 </td></tr></tbody></table>

cell specific analysis of arabidopsis leaves using fluorescence activated cell sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Watch this Scientific Journal Video about Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting at JoVE.com

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Способ получения<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Лист протопласты, которые совместимы с флуоресценции активирован сортировки клеток (FACS), что позволяет для исследования конкретных клеточных популяций. Этот метод совместим с любой<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Линия, которая выражает GFP в подмножество клеток.

Сотовые конкретного анализа<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Листья Использование флуоресценции клеток, активированных Сортировка

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Флуоресценция Активированный сортировки клеток растений Протопласты

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Исследование тканей и органов конкретных Фитохром ответы с помощью FACS-помощь камерного типа Конкретные профилирования выражения в Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Heterokaryon Техника для анализа типа клеток конкретных Локализация

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Липидов везикул-опосредованной аффинной хроматографии с использованием магнитных Активированный сортировки клеток (LIMACS): новый метод для анализа Белково-липидные взаимодействия

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Бромдезоксиуридин (BrdU) Маркировка и последующих флуоресценции Активированный сотовый Сортировка по культуре независимой Определение растворенного органического углерода, разрушающих бактериопланктона

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Простой метод для работы с изображениями Arabidopsis Листья Использование Perfluorodecalin как инфильтративный Средний изображений

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Оптимизирован Окрашивание и распространения методов моделирования для деления клеток Мониторинг использования красителей сотовых слежения

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Выделение нормальных и раковых связанных Фибробласты из свежих тканей флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Одноклеточная микро-аспирация в качестве альтернативной стратегии для флуоресценции активированной сортировки клеток для гигантского разделения вирусной смеси

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Флуоресценция активированная сортировка клеток для изоляции популяций склеакттинских клеток

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...