Name: a new screening method for the directed evolution of thermostable bacteriolytic enzymes
Uploaded: 2012-11-07T13:00:00
Duration: 13 min 30 s
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Los autores desean agradecer a Emilija Renke y Yu Janet de asistencia técnica. DCN con el apoyo de subvenciones del Departamento de Defensa estadounidense (DR080205, DM102823, OR09055, y OR090059). RDH es apoyado por una beca de la Estación Experimental de Agricultura de Maryland y una Beca de Formación NIH en Biología Celular y Molecular.

1. Determinar las condiciones óptimas de calefacción Primero, uno debe determinar experimentalmente la temperatura de incubación y tiempo óptimos a usar para la etapa de calentamiento en el ensayo. Para nuestro modelo PlyC, es importante notar que E. co-coli transformadas con genes plyCA y plyCB en plásmidos de expresión independientes ha mostrado para formar una holoenzima PlyC completamente funcional 6. La preparación de 96 pocillos de microtitulación así como las condiciones de crecimiento celular y la técnica de réplica en placas posteriores fueron adaptados a partir de ejemplos proporcionados en la literatura 12-16. Un tiempo de incubación de 30 min será adecuado para este ensayo como resultados de los anteriores experimentos de inactivación térmica dictar una rápida pérdida de actividad durante el breve período de incubación en ambientes superiores a la temperatura fisiológica (observación no publicada). La temperatura de incubación óptima para PlyC fue aclarada por los siguientes pasos: <ol><li> Transform la construcción de expresión pBAD24: plyCA (Amp r) en el competente E. coli cepa DH5a pBAD33: plyCB (Cm r). </li><li> Placa de los transformantes sobre una placa de agar Luria-Bertani (LB) suplementado con ampicilina (100 mg / ml) y cloranfenicol (35 mg / ml). Se incuban las placas durante la noche a 37 ° C. </li><li> Con un palillo de dientes estéril, inocular una colonia individual en cada fila de pocillos (Figura 2a) en una solución estéril, transparente, de fondo plano de 96 pocillos, con tapa de placa de microtitulación que contiene 200 l de LB suplementado con ampicilina y cloranfenicol. </li><li> Segura colocar la placa de microtitulación de 96 pocillos en un 37 ° C incubadora de agitación y crecer las bacterias durante la noche a 300 rpm. </li><li> Recuperar la placa de microtitulación de 96 pocillos de los 37 ° C incubadora de agitación y la placa de réplica a una nueva placa de 96 pocillos de microvaloración de la siguiente manera: <ol class="lalpha"><li> Añadir 180 l de LB suplementado con ampicilina y cloranfenicola cada pocillo de la placa de réplica. </li><li> Transferir 20 l de bacterias de la placa original a los pocillos correspondientes en la placa de réplica. Esto debe resultar en un 600 OD inicial de ~ 0,5. </li></ol></li><li> Segura coloque la placa réplica en los 37 ° C incubadora de agitación e incubar la placa durante 1 hora a 300 rpm, a continuación, añadir el inductant. En el caso de los sistemas de expresión pBAD, la inductant es 0,25% de arabinosa. Otros sistemas de expresión puede requerir inductants diferentes. Coloque la placa posterior de la 37 ° C incubadora de agitación y se agita a 300 rpm durante un adicional de 4 horas para permitir la expresión de la proteína. Los niveles de expresión suelen oscilar entre 10-20 g de PlyC. </li><li> Una vez que ha concluido la expresión de proteínas, recuperar la placa de réplica y sedimentar las bacterias mediante la colocación de la placa de microtitulación de 96 pocillos en una centrífuga refrigerada que contiene un rotor oscilante-cubo que se adapte a placas de microtitulación de 96 pocillos. Centrifugar a 3.000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente.</li><li> Eliminar el sobrenadante por medios lentamente invirtiendo la placa de microtitulación y suavemente decantación de los medios. </li><li> Lisar las células mediante la adición de 50 l de B-PER II bacteriana del reactivo de extracción de proteína a cada pocillo. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Aumentar el volumen en cada pocillo a 120 l mediante la adición de 70 l de tampón fosfato salino (PBS) pH 7,2. </li><li> Agregar el debris celular insoluble por centrifugación de la placa a 3.000 rpm durante 10 min a 4 ° C en la centrífuga refrigerada. </li><li> Transferir 110 l de lisado crudo soluble a los correspondientes pocillos de una placa de termociclador de 96 pocillos. </li><li> Uso de 30 min como el tiempo de incubación predeterminado, exponer los lisados ​​solubles que residen actualmente en la placa de termociclador de 96 pocillos a una amplia gama que abarca gradiente de temperatura 15-20 ° C. Tenga en cuenta, el objetivo es determinar a qué temperatura de una enzima particular pierde&gt; 95% de la actividad catalítica. </li><li> Después de la incubación, la incubación de 96 pocillosplaca de termociclador a 4 ° C durante 5 min y transferir 100 l de los lisados ​​solubles de la placa de termociclador de 96 pocillos a su localización correspondiente bien en la final de 96 pocillos placa de microtitulación. </li><li> Con un multipipettor 12-canales, añadir 100 ml de la cepa de GAS D471 a cada pocillo. Nota, D471 células son originalmente liofilizó a partir de cultivos de una noche y se resuspendieron con PBS pH 7,2 para obtener una OD 600 de ~ 2,0. </li><li> Inmediatamente se coloca la placa de 96 pocillos en el espectrofotómetro de microplacas y controlar la cinética enzimática midiendo la OD 600 cada 15 segundos durante 20 min. La incubación temperatura más baja que correspondía a pozos que carecían de un cambio en la densidad óptica (ΔOD ≤ 0,1) se define como la temperatura no permisiva. </li></ol> Después de una pantalla de temperatura amplio se realiza para identificar la temperatura no permisiva, los pasos anteriores pueden ser repetidos en un rango más estrecho de temperaturas (5 ° -10 ° C) para elucidarla precisa temperatura no tolerable para la enzima de interés. Nota, la temperatura no permisiva identificado en este ensayo puede ser diferente de la temperatura de fusión dilucidado por otros medios debido a diferencias en el volumen, concentración, etc 2. Generación de la biblioteca de mutantes La creación de la biblioteca de mutantes que se proyectarán implica la incorporación de mutaciones al azar por una polimerasa de DNA propensa a errores con un sesgo mínimo de nucleótidos en el gen plyCA usando el kit de mutagénesis aleatoria GeneMorph II como sigue: <ol><li> Diseñar cebadores de nucleótidos con temperaturas de fusión similares (T m) entre 55-72 ° C con los sitios de restricción de elección en el extremo 5 &#39;y 3&#39; del gen plyCA. </li><li> Dado que la tasa de mutación deseada es de 2-3 nucleótidos por plyCA (1,4 kb), el uso de las concentraciones de los componentes de reacción de PCR así como las condiciones del termociclador recomendadas por el fabricante para f mutaciones bajarequencies (0-4,5 por kb). </li><li> Clonar los genes mutados plyCA en el vector de expresión pBAD24. </li><li> Transformar los constructos en un DH5a pBAD33: fondo plyCB y los transformantes de placas en placas de agar LB suplementado con ampicilina y cloranfenicol. </li><li> Además, transformación y placa DH5a pBAD33: plyCB con el vector de expresión que contiene el gen pBAD24 PESO plyCA. Las colonias de esta placa servirán como los controles efectuados durante la proyección. </li></ol> 3. Microtitulación de 96 pocillos placa de Preparación y Condiciones de Crecimiento Celular <ol><li> Llenar cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos con 200 l de LB suplementado con ampicilina y cloranfenicol. </li><li> Siguiendo el esquema de placa de microtitulación (figura 2b), seleccionar cuidadosamente una colonia individual de las placas de agar durante la noche con un palillo de dientes esterilizado e inocular las bacterias en el designado bien de la 96 pla bien microtitulaciónTE. Es esencial para garantizar que sólo una colonia por pocillo se inocula. </li><li> Agitar la placa firmemente anclado 96 pocillo de microtitulación a 300 rpm durante la noche a 37 ° C. </li></ol> 4. Revestimiento de la reproducción, inducción de la expresión de proteínas y preparación Lysate <ol><li> Siga los pasos 1.5-1.11 de la sección titulada &quot;Determinación de las condiciones óptimas de calentamiento&quot; con una modificación. La tienda de la placa original a 4 º C después de la etapa de réplica en placas ha concluido. </li><li> Después del paso 1,11, la transferencia de 110 l de lisado crudo soluble a los correspondientes pocillos de una placa de termociclador de 96 pocillos, excepto para el control positivo los pocillos A1-D1. Con respecto a los lisados ​​de control positivo (es decir, que no lisados ​​se calienta), la transferencia de 100 l de los lisados ​​a los pocillos correspondientes en una nueva placa de 96 pocillos de microvaloración que servirá como la placa final de ensayo para el experimento y se almacena en hielo. </li></ol> 5. El tratamiento térmico Soluble Lysate <ol><li> Calentar el control negativo y soluble mutante lisados ​​limita en la actualidad en la placa de termociclador de 96 pocillos en el termociclador durante 30 min a la temperatura de incubación optimizado no permisiva determinado en el paso 1. </li><li> Después de incubación a temperatura no permisiva, se incuba la placa 96 termociclador bien a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Transferir 100 l de los lisados ​​solubles de la placa de termociclador de 96 pocillos a sus ubicaciones idénticas así en la última placa de 96 pocillos ensayo de microtitulación que contiene ya los lisados ​​de control solubles positivos. </li><li> Con un multipipettor 12-canales, añadir 100 ml de la cepa de GAS D471 a cada pocillo. Inmediatamente se coloca la placa en el espectrofotómetro de microplacas. </li><li> Monitorear la cinética enzimática midiendo la OD 600 cada 15 seg durante 20 min. <ol class="lalpha"><li> Una variante PlyC con comportamiento progresado térmica se define como una construcción que puede disminuir la densidad óptica original en un 50 por ciento en menos de 900 segundos a latemperatura no tolerable. Además, los controles positivos (es decir, no calentado, WT PlyC) necesita mostrar actividad catalítica WT (t 1/2 ≤ 100 seg) y los controles negativos (es decir, calentado, WT PlyC) debe ser desprovisto de actividad. </li></ol></li><li> Una vez que una variante PlyC con progresado comportamiento térmico se identifica, recuperar la placa original almacenado a 4 ° C y se inoculan bacterias de la persona bien específico para el mutante de interés en medio LB fresco suplementado con ampicilina y cloranfenicol. Crece el inóculo durante la noche a 37 ° C. </li><li> Extraer y purificar ADN plasmídico a partir del cultivo y luego someter a secuenciación para identificar las mutaciones de nucleótidos que inferir el comportamiento térmico mejorado para PlyCA. Adicionalmente, suplementar una pequeña alícuota del cultivo durante la noche con 10% de glicerol y se almacena a -80 ° C para su uso posterior. </li></ol>

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No hay conflictos de interés declarado.

Este protocolo, descrito en la Figura 1, se presenta una metodología bien 96 placa de microtitulación que permite utilizar evolución dirigida para aumentar la termoestabilidad de cualquier enzima bacteriolítica. Mediante el uso de una ADN polimerasa propensa a errores, se pueden introducir mutaciones al azar que aumentan la estabilidad general cinética de la molécula traducido bacteriolítica de interés, que es típicamente debido a las reorganizaciones molecular que consiste en aumentar electrostática, puente disulfuro y por interacciones hidrofóbicas que generan mejorado embalaje molecular, modificaciones mejoradas de las redes de carga superficial o refuerzo de un estado de oligomerización superior 17-18. Después de la introducción de mutaciones de nucleótidos, un procedimiento de cribado extenso se utilizó a continuación para identificar las mutaciones que son térmicamente beneficioso. Los resultados representativos se presentan aquí se basan en una ronda de mutagénesis al azar. En realidad, se ha sugerido queal menos tres rondas sucesivas de mutagénesis aleatoria, cada uno usando el mutante más robusto como el enzima de plomo, seguido por combinación aleatoria de ADN es apropiado para este tipo de estudios dirigidos comportamiento evolución térmica 2. Es importante comprender que mientras que este protocolo identifica las mutaciones que aumentan la estabilidad cinética, estas variantes no necesariamente han aumentado termoestabilidad. Una molécula se considera termoestable cuando tiene la capacidad de conservar su estructura a una temperatura alta. Sin embargo, en el ensayo presentado, la actividad residual de los lisados ​​mutantes no se analizan a la misma temperatura que se incubaron inicialmente menos durante la etapa de tratamiento térmico y por lo tanto uno se puede seleccionar para las mutaciones que promueven el replegamiento en lugar de termoestabilidad mejorada 19. Mientras que estamos extrapolando comportamiento térmico como una indicación de la estabilidad térmica, la estabilidad térmica verdadero debe ser medido empíricamente por biophyscos métodos tales como dicroísmo circular (CD), calorimetría diferencial de barrido (DSC) y fluorimetría de exploración diferencial (DSF). Los datos preliminares de experimentos de CD y DSF sugieren que varios candidatos identificados a partir de la metodología presentada en efecto, visualizar termoestabilidad progresado (datos no mostrados). Aunque la metodología que se presenta aquí es específico para implementar el comportamiento térmico aumentado a PlyC, esta misma metodología, además, puede ser empleado para mejorar la actividad térmica a otras enzimas bacteriolíticas con algunas modificaciones menores de variables tales como tampones, las tasas de mutación, las condiciones de calentamiento y sistemas de expresión. Una variable fundamental asociado con este ensayo se refiere a la tasa de mutación de nucleótidos de la ADN polimerasa propensa a errores. Hemos elegido utilizar el error-prone Mutazyme ADN polimerasa II en nuestro ensayo de evolución dirigida, debido a la evidencia experimental que sugiere que esta enzima en particular muestra la menor cantidad de sesgo conse refiere a que los nucleótidos están aleatoriamente incorporará en el gen de interés en comparación con otras técnicas de mutagénesis al azar tales como el uso de hidroxilamina, mutator E. cepas de E. coli y otro ADN propenso a errores polyermases 20. En general, la disminución de las tasas de mutación tienden a ser más deseable por dos razones. En primer lugar, la termoestabilidad de ingeniería a las proteínas típicamente consiste en sustituciones de aminoácidos relativamente pocos aminoácidos. Las altas tasas de mutación puede provocar dramáticas alteraciones estructurales de moléculas particulares que definitivamente puede resultar en mal plegamiento estructural y las discrepancias funcionales. Por ejemplo, la incorporación de residuos de prolina y glicina pueden interrumpir alfa estructuras secundarias helicoidales 21. Segundo, las tasas altas de mutación de nucleótidos aumentar las posibilidades de incorporación de codones de parada prematuros, lo que resulta en moléculas truncadas que son biológicamente inactivos. En general, la disminución de las tasas de mutación son preferidos debido a las tasas de error más baja en el resultado accumulción de mutaciones de adaptación mientras que los altos índices de mutación generar mutaciones neutrales o nocivas 22. Para cada ronda de mutagénesis al azar, otra variable crítica que se debe optimizar la temperatura de incubación implica utilizado durante el proceso de selección. Selección de la experimental no permisiva temperatura es relativamente difícil. Inicialmente se utiliza una temperatura de incubación que era 10 ° C más alta que la temperatura no permisiva de PlyC, sin embargo después de filtrar las 3.000 mutantes, no hemos podido identificar cualquier mutaciones ventajosas. Teniendo en cuenta la evolución dirigidas metodologías consisten en identificar secuencialmente beneficiosos sustituciones de aminoácidos que tienen efectos aditivos, se determinó que una temperatura menos rigurosas debe utilizarse durante el proceso de selección, aún si no aumentó la posibilidad de generar falsos positivos. Como tal, se utilizó una temperatura de incubación que era sólo unos pocos grados por encima de la no-permissive temperatura y volvieron a seleccionar los candidatos seleccionados para descartar los falsos positivos. Decidimos utilizar una temperatura de incubación que no era demasiado templado (≤ 1 ° C más alta que la más baja temperatura no tolerable) y por el contrario no dura demasiado (≥ 5 ° C más alta que la más baja temperatura no permisiva). La temperatura ideal se decidió utilizar en este ensayo particular era un moderado 2 ° C más alta que la determinada experimentalmente temperatura no tolerable. Elegir una temperatura que es demasiado suave dará lugar a una mucho mayor tasa de falsos identificación positiva que el ~ 20% se observó (Tabla I) cuando se utiliza una temperatura de incubación moderada. Además, utilizando una temperatura de incubación que es demasiado duro podría resultar en la imposibilidad de identificar mutantes con comportamiento térmico mejorado de manera significativa. Por ejemplo, utilizando una temperatura de incubación de ≥ 5 ° C habría dado lugar a la incapacidad de identificar laprometiendo mutante 29C3, así como la mayoría de los otros candidatos seleccionados en la primera ronda de selección. En resumen, se proporciona un protocolo para la ingeniería de enzimas bacteriolíticas para adquirir estabilidad cinética mejorada. Por otra parte, este mismo ensayo, sin los pasos de calentamiento, se puede utilizar para la detección de mutaciones que aumentan la actividad catalítica. Aumentar tanto la actividad catalítica y la estabilidad térmica es un obstáculo importante en el desarrollo frente a cualquier enzima terapéutica. Aunque los detalles de este protocolo son específicos de la PlyC endolisina, la metodología se puede adaptar a cualquier enzima bacteriolítica con sólo unas pocas modificaciones. Se presentaron los resultados preliminares a partir de sólo la primera ronda de mutagénesis que valida que la funcionalidad del ensayo, lo que resulta en la aplicación y la identificación de mutaciones que generan un aumento de la termoestabilidad molecular de magnitud significativa.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> B-PER II proteína bacteriana reactivo de extracción </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78260 </td></tr><tr><td> GeneMorph II Kit de mutagénesis aleatoria </td><td> Agilent Technologies </td><td> 200500 </td></tr><tr><td> Borrar de 96 pocillos de fondo plano placa de microtitulación con tapa </td><td> BD Vacutainer Labware Médico </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> 96 Bueno Nonskirted placas PCR </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-232 </td></tr><tr><td> Rotor basculante </td><td> Eppendorf </td><td> A-2-DWP </td></tr><tr><td> Ampicilina sal sódica </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td></tr><tr><td> El cloranfenicol </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP904 </td&gt; </tr><tr><td> Arabinosa </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2504 </td></tr><tr><td> Vector de expresión pBAD24 </td><td> ATCC </td><td> 87399 </td></tr><tr><td> Vector de expresión pBAD33 </td><td> ATCC </td><td> 87402 </td></tr></tbody></table>

a new screening method for the directed evolution of thermostable bacteriolytic enzymes

Evolución dirigida se define como un método para aprovechar la selección natural con el fin de diseñar proteínas de adquirir propiedades particulares que no están asociados con la proteína en la naturaleza. La literatura ha proporcionado numerosos ejemplos sobre la aplicación de la evolución dirigida a alterar con éxito especificidad molecular y catálisis 1. La principal ventaja de la utilización de la evolución dirigida en lugar de más racional enfoques para la ingeniería molecular se refiere al volumen y la diversidad de las variantes que pueden ser seleccionados 2. Una posible aplicación de la evolución dirigida consiste en la mejora de la estabilidad estructural de las enzimas bacteriolíticas, tales como endolisinas. Bacteriófago codificar y expresar endolisinas para hidrolizar un enlace covalente crítico en el peptidoglicano (es decir, la pared celular) de las bacterias, lo que resulta en la lisis de la célula huésped y la liberación de los viriones progenie. En particular, estas enzimas tienen la capacidad de inducir la lisis extrínsecamente a Susceptbacterias ible en la ausencia de fagos y, además, se han validado tanto in vitro como in vivo por su potencial terapéutico 3-5. El tema de nuestro estudio evolución dirigida implica la PlyC endolisina, que se compone de subunidades PlyCA y PlyCB 6. Cuando se purificó y se añadió extrínsecamente, la holoenzima PlyC lisa los estreptococos del grupo A (GAS), así como otros grupos de estreptococos en cuestión de segundos y, además, ha sido validado in vivo contra GAS 7. Significativamente, el seguimiento cinética de enzimas residuales después de incubación a temperatura elevada proporciona evidencia clara de que PlyC pierde actividad lítica abruptamente a 45 ° C, lo que sugiere una vida media corta terapéutico, lo que puede limitar el desarrollo adicional de esta enzima. Otros estudios revelan la falta de estabilidad térmica se observa solamente para la subunidad PlyCA, mientras que la subunidad PlyCB es estable hasta ~ 90 ° C (observación no publicada). Además de PlyC, hay sarias ejemplos en la literatura que describen la naturaleza termolábil de endolisinas. Por ejemplo, el Staphylococcus aureus endolisina LysK y Streptococcus pneumoniae endolisinas Cpl-1 y Pal perder actividad espontáneamente a 42 ° C, 43,5 ° C y 50,2 ° C, respectivamente 8-10. De acuerdo con la ecuación de Arrhenius, que relaciona la velocidad de una reacción química a la temperatura presente en el sistema en particular, un aumento en la termoestabilidad se correlacionan con un aumento de la esperanza de vida de estante 11. Con este fin, la evolución dirigida ha demostrado ser una herramienta útil para alterar la actividad térmica de varias moléculas en la naturaleza, pero nunca ha esta tecnología particular ha explotado con éxito para el estudio de las enzimas bacteriolíticas. Asimismo, las cuentas de éxito para progresar en la estabilidad estructural de esta clase particular de los antimicrobianos en conjunto son inexistentes. En este vídeo, se emplea una metodología novedosa que utiliza un error-pruna polimerasa de ADN seguido por un proceso de selección optimizada utilizando un formato de 96 pocillos placa de microtitulación para identificar las mutaciones de la subunidad PlyCA de la PlyC endolisina estreptocócica que se correlacionan con un aumento de la estabilidad cinética enzimática (Figura 1). Los resultados después de sólo una ronda de mutagénesis al azar sugieren la metodología es la generación de variantes PlyC que retienen más del doble de la actividad residual en comparación con los de tipo salvaje (WT) PlyC después de tratamiento a temperatura elevada.

Al término de la primera ronda de mutagénesis aleatoria, más de 6.000 mutantes PlyC fueron seleccionados y un total de 35 mutantes con comportamientos potencialmente aumentado térmico fueron identificados, seleccionados y secuenciados. El análisis genómico, que se resumen en la Tabla I, indica que de los 35 candidatos, 7 de las construcciones contenidas WT secuencias PlyCA a nivel de traducción, correspondiente a los falsos positivos identificados por el ensayo. De los restantes 28 candidatos, el rango de mutación fue de 1 a 6 mutaciones de nucleótidos con una tasa de mutación promedio de 2,75 nucleótidos por plyCA gen, que estaba en el intervalo 2-3 mutación de nucleótidos que se ha orientado. A nivel de traducción, esta gama particular de mutación de nucleótidos y la frecuencia se obtuvo un rango ácido amino mutación de 1 a 5 aminoácidos, con una tasa de mutación promedio de 1,9 mutaciones de aminoácidos por PlyCA polipéptido. De los 28 candidatos con al menos un aminoácido Mutation, cuatro de estos constructos mutantes fueron elegidos al azar para una caracterización adicional para validar que el proceso de revisión exhaustiva de la metodología de evolución dirigida fue de hecho funcionando correctamente. Las enzimas PlyC mutantes se purificaron a homogeneidad&gt; 95% basado en el análisis de SDS-PAGE como se ha descrito previamente 6-7. Cinética enzimática de WT PlyC y cada uno de los cuatro mutantes PlyC se caracterizaron en concentraciones molares iguales después de incubar las enzimas purificadas a diversas temperaturas elevadas. Actividad se controló después de la adición de D471 GAS midiendo la densidad óptica a 600 nm cada 15 segundos durante 20 min. La actividad se define como la velocidad máxima de la enzima residual después de la incubación de calor. De los cuatro candidatos seleccionados al azar para la caracterización adicional, 29C3 mutante mostró el comportamiento térmico más mejorada. El comportamiento térmico de WT PlyC y 29C3 se investigó a diferentes temperaturas, mientras que la incubación y el ensayo de la actividad en PBS pH 7,2 a80 nM y 40 nM concentraciones, respectivamente. Los 45-50 ° C experimentos de incubación (Figura 3) se realizó en un termociclador donde las muestras se incubaron en una pared delgada placa de termociclador 96 pocillos en un volumen total de 120 l. El 35 ° C, 40 ° C y 45 ° C experimentos de incubación (Figura 4 y 5) se realizaron en un bloque de calor donde las muestras se incubaron en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en un volumen total de 1,3 ml. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. PESO PlyC y 29C3 no mostró ninguna diferencia significativa en la estabilidad cinética a temperatura ambiente (25 ° C) como se muestra en el primer conjunto de barras de la Figura 3. Sin embargo, después de una incubación a corto plazo de 30 min de temperaturas que oscilan entre 45-50 ° C, la actividad de 29C3 era sustancialmente mayor que la actividad específica para el WT construir en cada punto de temperatura. Por ejemplo, WT PlyC muestra una pérdida de 44% de la actividad a 45,2° C mientras que 29C3 mostró sólo una pérdida de 2% en la actividad a la misma temperatura. Estudios a largo plazo de incubación que comparan la actividad residual de ambos WT PlyC y 29C3 se realizaron adicionalmente a 35 ° C y 40 ° C que implica la medición de la actividad residual a las 24 y 48 puntos de tiempo hr. A 35 ° C, 29C3 muestra 41% y la actividad 176% mayor que WT PlyC a 24 y 48 hr puntos de tiempo de incubación, respectivamente (Figura 4a). A 40 º C, 29C3 muestra 28% y la actividad 107% mayor que WT PlyC a 24 y 48 hr puntos de tiempo de incubación, respectivamente (Figura 4b). La actividad residual de WT PlyC y 29C3 también se controlaron cada 20 minutos durante un total de 3 horas a 45 ° C. PESO PlyC sólo fue capaz de retener 21% de actividad después de una incubación de 3 horas a esta temperatura mientras que 29C3 fue capaz de retener 46% de actividad. La vida media (t 1/2) para WT PlyC y 29C3 eran 67 y 147 min, respectivamente, sugieren<html> ING 29C3 que tiene un aumento de 2,2 veces en la estabilidad cinética a 45 ° C (Figura 5). <table border="1"><tbody><tr><td> Total de la Ronda 1 Candidatos </td><td> 35 </td></tr><tr><td> Los candidatos con el tiempo de secuencia PlyCA </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Los candidatos con ≥ 1 mutación de aminoácido </td><td> 28 </td></tr><tr><td> - Tarifa media mutación de nucleótidos (nt / plyCA) </td><td> 2,75 </td></tr><tr><td> - Rango de mutación de nucleótidos (nt) </td><td> 1-6 </td></tr><tr><td> - Media aminoácidos tasa de mutación (AA / PlyCA) </td><td> 1,9 </td></tr><tr><td> - Gama Amino Acid Mutación (AA) </td><td> 1-5 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Análisis genómico de candidatos. pload/4216/4216fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Metodología dirigida ensayo de evolución. En la evolución dirigida, se comienza con la enzima de plomo, lo que sería PlyC WT para la primera ronda. Una biblioteca de mutantes PlyC que contienen mutaciones aleatorias de nucleótidos recomendaciones para el gen plyCA continuación, se construye por una polimerasa de DNA propensa a errores, se clonó en el vector de expresión pBAD24 y se transforma en la E. coli cepa DH5a que ya contiene pBAD33:. plyCB transformantes individuales se inocularon en su propio específico pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos. A través de un proceso de selección extensa, mutantes individuales PlyC que son catalíticamente activo tras la incubación a una temperatura no permisible se clasifican como mutantes con estabilidad cinética mejorada. Theconstruct muestra el comportamiento más avanzado térmico por consiguiente se convierte en la enzima principal para la siguiente ronda de mutagénesis aleatoria. En general, hay tres rondas completas de random seguido por mutagénesis aleatoria de ADN que resulta en una molécula con bacteriolítica evolucionó el comportamiento térmico. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4216/4216fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig2.jpg" /> Figura 2. 96 así plantillas de la placa de microtitulación para el ensayo de evolución dirigida. El esquemática placa de microtitulación durante la determinación de las condiciones de calentamiento óptimos (Figura 2a) consiste en la inoculación de un único clon parental PESO PlyC en cada fila de la placa de microtitulación. El esquema de placa de microtitulación durante el cribado mutante (Figura 2b) consiste en inocular cada pocillo en la columna 1 con un único clon parental PESO PlyC así como la inoculación de cada pocillo de las columnas 2-12 con un distinto clon mutante PlyC. Los pocillos A1-D1 se designan para los controles positivos parentales, que cooperanNSISTE de WT PlyC construcciones no expuesto a la temperatura de incubación no permisible. Wells E1-H1 se designan para los controles negativos parentales, que consisten en WT construcciones PlyC que están expuestos a la temperatura de incubación no permisible. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig3.jpg" /> Figura 3. Análisis de la actividad cinética residual comparando PESO PlyC y 29C3. Las enzimas se purificaron hasta homogeneidad y se incubaron durante 30 min en un termociclador a concentraciones molares iguales a la temperatura ambiente ya sea o en un gradiente de temperatura que oscila entre 45-50 ° C. La actividad enzimática se correlaciona con la velocidad máxima aparece después de la incubación temperatura específica. Con la excepción de 25 ° C y 47,7 ° C, la variación en la actividad entre el TE y 29C3 a cada temperatura correlacionada con un valor de p &lt;0,05. Todos los datos se presentan como la media ± SEM de tres experimentos independientes. </p&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig4.jpg" /> Figura 4. Análisis de la actividad cinética residual comparando PESO PlyC a 29C3 a 35 ° C y 40 ° C. concentraciones molares iguales de purificado PESO PlyC y 29C3 se incubaron en un bloque de calor a 35 ° C (Figura 4a) o 40 ° C (Figura 4b). La actividad enzimática residual se midió a 24 y 48 puntos de tiempo hr. La actividad desplegada por cada constructo se normalizó a la velocidad máxima se muestra en el tiempo cero punto. La variación en la actividad entre el TE y 29C3 en cada punto de temperatura y tiempo correlacionado con un valor de p &lt;0,05. Todos los datos se presentan como la media ± SEM de tres experimentos independientes. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig5.jpg" /> Figura 5. Análisis de la actividad cinética residual comparandoPESO PlyC a 29C3 a 45 ° C. concentraciones molares iguales de purificado PESO PlyC y 29C3 se incubaron en un bloque de calor a 45 ° C y la actividad enzimática residual se midió cada 20 min durante 3 horas. La actividad desplegada por cada constructo se normalizó a la velocidad máxima se muestra en el tiempo cero punto. Con la excepción de los puntos de datos en 20 min, la variación en la actividad entre el TE y 29C3 en cada punto de tiempo correlacionado con un valor de p &lt;0,05. Todos los datos se presentan como la media ± SEM de tres experimentos independientes.

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A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Un nuevo método de evolución dirigida específicamente al ámbito de la ingeniería termoestabilidad fue desarrollado y validado tanto para las enzimas bacteriolíticas. Después de sólo una ronda de mutagénesis al azar, una enzima bacteriolítica evolucionado, PlyC 29C3, muestra mayor que el doble de la actividad residual en comparación con la proteína de tipo salvaje después de incubación a temperatura elevada.

Un método de screening para la evolución dirigida de enzimas termoestables bacteriolítica

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

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Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Método de aglutinación de partículas para la identificación de poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Investigación

Inmunología e Infección

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

Selección de Plasmodium falciparum Los parásitos de cytoadhesion a las células cerebrales endoteliales humanas

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Una introducción a las avispas parasitarias de<em&gt; Drosophila</em&gt; Y la respuesta inmune antiparasitario

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

Un sistema de neuronas cultivo primario para el estudio de la latencia del virus del herpes simple y Reactivación

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Ensayo de co-inmunoprecipitación para el estudio de las interacciones funcionales entre los receptores y enzimas

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure makes the spore extremely stable and resistant and has suggested the use of the spore as a platform to display heterologous molecules. So far, a variety of antigens and enzymes have been displayed on spores of Bacillus subtilis and of a few other species, initially by a recombinant approach and, then, by a simple and efficient nonrecombinant method. The nonrecombinant display system is based on the direct adsorption of heterologous molecules on the spore surface, avoiding the construction of recombinant strains and the release of genetically modified bacteria in the environment. Adsorbed molecules are stabilized and protected by the interaction with spores, which limits the rapid degradation of antigens and the loss of enzyme activity at unfavorable conditions. Once utilized, spore-adsorbed enzymes can be collected easily with a minimal reduction of activity and reused for additional reaction rounds. In this paper is shown how to adsorb model molecules to purified spores of B. subtilis, how to evaluate the efficiency of adsorption, and how to collect used spores to recycle them for new reactions.

This protocol focuses on the use of bacterial spores as a &#34;live&#34; nanobiotechnological tool to adsorb heterologous molecules with various biological activities. The methods to measure the efficiency of adsorption are also shown.

Adsorción de esporas como un sistema de visualización Nonrecombinant para enzimas y antígenos

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic biotinylation by the E. coli biotin-protein ligase BirA is highly specific and allows for the biotinylation of target proteins in their native environment; however, the current usage of BirA mediated biotinylation requires the presence of a synthetic acceptor peptide (AP) in the target protein. Therefore, its application is limited to proteins that have been engineered to contain the AP. The purpose of the present protocol is to use the bacterial display of a peptide derived from an unmodified target protein to select for BirA variants that biotinylates the peptide. The system is based on a single plasmid that allows for the co-expression of BirA variants along with a scaffold for the peptide display on the bacterial surface. The protocol describes a detailed procedure for the incorporation of the target peptide into the display scaffold, creation of the BirA library, selection of active BirA variants and initial characterization of the isolated BirA variants. The method provides a highly effective selection system for the isolation of novel BirA variants that can be used for the further directed evolution of biotin-protein ligases that biotinylate a native protein in complex solutions.

Here we present a method to select for novel variants of the E. coli biotin-protein ligase BirA that biotinylates a specific target peptide. The protocol describes the construction of a plasmid for the bacterial display of the target peptide, generation of a BirA library, selection and characterization of BirA variants.

Pantalla de péptido sinábicos para la selección de nuevas enzimas biotinylantantes

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...