Name: multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit
Uploaded: 2013-06-28T12:00:00
Duration: 22 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit at JoVE.com

저자는 SSGCID 컨소시엄의 모든 구성원을 감사드립니다. SSGCID의 목표 달성은 에메랄드 바이오의 모든 팀 구성원의 엄청난 노력에 의해 가능하게된다. 이 연구는 알레르기와 감염증, 건강 및 보건 복지부의 국립 연구소의 국립 연구소에서 연방 계약 번호 HHSN272200700057C에서 후원했다.

<ol>
	<li>Lowen, A. C., Mubareka, S., Steel, J., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+transmission+is+dependent+on+relative+humidity+and+temperature.">Influenza virus transmission is dependent on relative humidity and temperature.</a> PLoS Pathogens. 3 (10), 1470-1476 (2007).</li><li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+structural+characterization+of+a+host-adapting+amino+acid+in+influenza+virus.">Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus.</a> PLoS Pathog. 6, e1001034 (2010).</li><li>Lorimer, D., Raymond, A., Walchli, J., Mixon, M., Barrow, A., Wallace, E., Grice, R., Burgin, A., Gene Stewart, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composer:+database+software+for+protein+construct+design,+codon+engineering,+and+gene+synthesis.">Composer: database software for protein construct design, codon engineering, and gene synthesis.</a> BMC Biotechnol. 9, 36 (2009).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration,+scaling,+space-group+assignment+and+post-refinement.">Integration, scaling, space-group assignment and post-refinement.</a> Acta Cryst. D. 66, 125-132 (2010).</li><li>McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007).</li><li>Kuzuhara, T., Kise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+the+influenza+A+virus+RNA+polymerase+PB2+RNA-binding+domain+containing+the+pathogenicity-determinant+lysine+627+residue.">Structural basis of the influenza A virus RNA polymerase PB2 RNA-binding domain containing the pathogenicity-determinant lysine 627 residue.</a> J. Biol. Chem. 284, 6855-6860 (2009).</li><li>Murshudov, G. N., Skub&#224;k, P., Lebedev, A. A., Pannu, N. S., Steiner, R. A., Nicholls, R. A., Winn, M. D., Long, F., Vagin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Cryst. D. 67, 355-367 (2011).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+classical+density+modification.">Recent developments in classical density modification.</a> Acta Cryst. D. 66, 470-478 (2010).</li><li>Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., Murray, L. W., Richardson, J. S., Richardson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MolProbity:+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography.">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst. D. 66, 12-21 (2010).</li><li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast.">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Mol. Cell. 5, 865-876 (2000).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Cryst. D. 66, 486-501 (2010).</li><li>Raymond, A. C., Haffner, T. E., Ng, N., Lorimer, D., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+design,+cloning+and+protein-expression+methods+for+high-value+targets+at+the+Seattle+Structural+Genomics+Center+for+Infectious+Disease.">Gene design, cloning and protein-expression methods for high-value targets at the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease.</a> Acta Cryst. F. 67, 992-997 (2011).</li><li>Smith, E. R., Begley, D. W., Anderson, V., Raymond, A. C., Haffner, T. E., Robinson, J. I., Edwards, T. E., Duncan, N., Gerdts, C. J., Mixon, M. B., Nollert, P., Staker, B. L., Stewart, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Protein+Maker:+an+automated+system+for+high-throughput+parallel+purification.">The Protein Maker: an automated system for high-throughput parallel purification.</a> Acta Cryst. F. 67, 1015-1021 (2011).</li></ol>

저자는 에메랄드 바이오 주식 회사의 직원입니다

멀티 타겟 병렬 처리 구조 기반 약물 설계 약물 발견에 중요한 역할을한다. SSGCID는 NIAID 종류 AC 병원균부터 3 차원 단백질 구조와 과학 커뮤니티를 제공하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 널리 사용되는 이러한 구조 정보를 만드는 것은 궁극적으로 구조 기반 약물 설계를 가속화하는 역할을합니다. MTPP 방식의 첫 번째 중요한 단계는 구조 디자인입니다. 각 대상 단백질의 여러 구조는 성공적인 구조 결정 및 증가 턴어라운드의 가능성을 증가시킵니다. 그것은 몇 가지 단백질 구조는 파이프 라인의 단계에서 실패 할 불가피하다. PIPE 복제 방법을 구현하는 것은 노동 집약적 인 정제 단계없이 96 - 웰 형식의 여러 구조의 생성을 허용하여 MTPP 방법을 지원합니다. 같은 96 - 웰 형식 (캘리퍼스 실험실에서 단백질 발현을 분석 할 수있는 능력 PIPE 복제 페어링칩 90) 더 전반적인 흐름을 촉진. 이러한 방법의 페어링 대규모 단백질 생산 및 정제의 성공을 보장 수용성 단백질을 생산하는 구조를 빠르게 식별 할 수 있습니다. MTPP 높은 처리량의 성공에 필수적인 측면은 단백질 메이커 (미국 특허 번호 6,818,060, 에메랄드 바이오) 악기입니다. 단백질 메이커 높은 처리량 단백질 생산 및 관련 구조 게놈 파이프 라인 연구 프로그램의 효율성을 향상하기 위해 특별히 개발 된 24 채널 병렬 액체 크로마토 그래피 시스템입니다. 단백질 메이커 앞에서 설명한 프로토콜을 사용하여 장점은 한 줄 FPLC 시스템에 비해 분명합니다. 한 사람은 8 시간 내에 병렬 48 대상을 정화 할 수 있습니다. 반면, 한 줄 FPLC 시스템을 사용하여 한 사람은 같은 시간 내에 네 개의 대상의 최대를 정화 할 수 있습니다. 각 대상에 대한 순도 높은 수준의구조 분석을위한 성장 단백질 결정의 이후 성공에 중요한 요소는 단백질 메이커로 달성했다. 제한 사항 및 문제 해결 X-선 결정학에 의해 입체 구조를 해결하는 것은 수용성 목적 단백질의 다량을 얻을 수 없다는 것입니다 중 하나는 많은 도전과 다단계 노력입니다. 용해도 문제를 극복하기 위해 구현 할 수있는 하나의 전략은 E.와 같은 다른 표현 호스트의 사용 대장균 세포는 몇 가지 중요한 진핵 번역 후 수정을 수행 할 수 없습니다. 이러한 번역 후 수정을 수행 할 수있는 각종 효모 발현, 곤충 및 포유 동물 세포 라인은 종종 적절한 대안이다. 표적 단백질은 종종 표현하지만, 표준 용해 조건에​​서 완전히 용해된다. 단백질 메이커 대체 세포 용해 상태의 신속한 테스트를위한 귀중한 자원이 될 수 있습니다로 스미스 등의 설명. 2011 13. 이 전략은 종종 목표는 파이프 라인을 통해 계속 이동해야합니다. 어떤 구조 유전체학 파이프 라인, 표준화 된 프로토콜은 파이프 라인 및 대상 개별 최적화를해야 할 수도 통해 나오는 모든 대상에 적합하지 않을 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 모든 동결 방지제에 대해 20 %의 에틸렌 글리콜을 사용하도록 선택했습니다. 이 조건이 적합하지 않습니다 경우에, 대안의 cryoprotectants 또는 농도 테스트해야 할 수도 있습니다. 각각의 단백질 대상의 고유 한 특성으로 인해, 속도 제한 및 구조를 결정하는 예측 단계는 결정됩니다. 최초의 스파 스 매트릭스 화면에서 최적화 단백질 결정화의 MTPP 파이프 라인 오프셋은 일반적으로 낮은 성공률. 상업적으로 이용 가능한 스파 스 매트릭스 화면에서 적중 각각의 초기 결정은 더욱 E-스크린 빌더 (에메랄드 바이오)에 최적화되어 있습니다. 최적화 화면이 AR 설계버퍼 염 및 첨가제의 농도 변화, 초기 크리스탈 히트의 상태를 운드. 성공적인 최적화 화면 회절 연구 및 구조 결정을위한 적합한 결정을 얻을 수 있습니다. 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID)가 내다 구조 유전체학 프로그램은 에메랄드 바이오와 함께 SSGCID (에메랄드 바이오, SeattleBiomed, 워싱턴 대학과 퍼시픽 노스 웨스트 국립 연구소) 세 가지 다른 태평양 북서부 기관에 자금을 제공 . 컨소시엄의 각 구성원은 NIAID 구조 유전체학 프로그램의 목표를 달성에 필요한 최첨단 기술을 적용하는 전문성을 위해 선택되었다. 지금까지 SSGCID은 세계에서 일곱 번째로 큰 기여자로 PDB 순위 그것으로 461 구조를 기탁했으며, 2011 년, 가장 생산. SSGCID의 프로토콜과 방법론을 혜택의 의도와 함께 제공됩니다사회 과학 및 감염성 질환의 연구를 영속.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Item</td>
 <td>Vendor</td>
 <td>Catalog number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>IDT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genes</td>
 <td>DNA 2.0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TE buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>provided in kit</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well half skirt PCR plates</td>
 <td>VWR</td>
 <td>10011-248</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFU Master Mix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6X Orange Loading Dye</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td>R0631</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X TAE</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T0280</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET28 vector</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-YT Broth</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101446-848</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycin</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>K2151 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Restriction Enzymes</td>
 <td>Fermentas</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick Gel Extraction Kit </td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28704</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Top 10 chemically comp cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C4040-06</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable Troughs (Sterile, 25 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>89094-662</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airpore covers (Rayon films for bio cultures)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>60941-086</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24-well blocks</td>
 <td>VWR</td>
 <td>13503-188</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAvac 96</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19504</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3) cells chemcomp (phageR)</td>
 <td>NEB</td>
 <td>C2527H</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% Glycerol</td>
 <td>VWR</td>
 <td>100217-622</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TB Media</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>T7060</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M Tris pH 8.0</td>
 <td>Mediatech</td>
 <td>46-031-CM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 M NaCl</td>
 <td>Teknova</td>
 <td>S0251</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Aldrich</td>
 <td>G7893-4L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>4145-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imidazole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>56749-1KG</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCEP</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>K831-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-arginine</td>
 <td>Amresco</td>
 <td>0877-500G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benzonase</td>
 <td>EMD</td>
 <td>70746-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lysozyme</td>
 <td>USB</td>
 <td>1864525GM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 kDa MWCO dialysis tubing</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>68100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra 10 ka MWCO concentrators</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HisTrap FF columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17-5255-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HiTrap Chelating columns</td>
 <td>GE</td>
 <td>17/0408-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Compact Jr crystallization plates </td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-XJR</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystalization screens</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylene Glycol 100%</td>
 <td>Emerald Bio</td>
 <td>EBS-250-EGLY</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Crystal Wand Magnetic Straight </td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-729</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounted CryoLoop 0.1-0.2 mm</td>
 <td>Hampton Research</td>
 <td>HR4-955</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ALS style puck</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Wand</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bent Tongs</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Puck Pusher</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

multi-target parallel processing approach for gene-to-structure determination of the influenza polymerase pb2 subunit

높은 악성 인플루엔자 변종 유행성 독감 발생은 전 세계적으로 인간의 인구의 대폭적인 병적 상태와 사망률의 원인이 될 수 있습니다. 혼자 미국에서 41,400 사망자와 1,860,000 입원의 평균은 매년 1 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 발생합니다. 효소의 기본적인 단백질이 소단위 (PB2)의 점 돌연변이는 인간 2 바이러스 감염의 적응에 연결되어있다. 이러한 연구의 결과는 따라서 항 바이러스 약물 표적으로서의 가능성을 강조, 독성 요인으로 PB2의 생물학적 중요성을 공개했다. 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID)가 내다 구조 유전체학 프로그램은 에메랄드 바이오와 함께 감염증 (SSGCID)의 시애틀 구조 유전체학 센터를 구성하는 세 가지 다른 태평양 북서부 기관에 자금을 제공한다. SSGCID는 thre에 함께 과학계를 제공하기 위해 최선을 다하고 있습니다NIAID 종류 AC 병원균의 전자 차원 단백질 구조. 과학계에서 사용할 수 같은 구조 정보를 만드는 것은 구조 기반 약물 설계를 가속화하는 역할을한다. 구조 기반 약물 설계 약물 개발에 중요한 역할을한다. 병렬로 여러 대상을 추구하는 것은 크게 통로 또는 전체 단백질 가족을 대상으로 새로운 리드 발견을위한 성공의 기회를 증가합니다. 에메랄드 바이오 컨소시엄을 지원하는 유전자에 대한 구조 결정을위한 높은 처리량, 멀티 타겟 병렬 처리 파이프 라인 (MTPP)를 개발했다. 여기에서 우리는 네 가지 독감 변종에서 PB2 단위체의 구조를 결정하는 데 사용되는 프로토콜을 설명합니다.

다음과 같은 결과를 설명하는 프로토콜의 예상 결과를 설명하고, PB2, 관찰 결과의 경우합니다. 인플루엔자 바이러스 중합 효소의 소단위 PB2 다섯 전체 길이 대상 아미노산 서열 (그림 2) 설계되었습니다, 유전자 작곡가를 사용하여. PB2 시퀀스는 다시 변환 많은 엔지니어링 단계 3 대상, E.의 표현에 최적화 된 코돈 조화 시퀀스의 결과되었습니다 대장균. IPCR 제품 (그림 3B), 서른 넷 구조의 총에서 성공적으로 그림 3A와 같이 파이프 복제 3를 사용하여 그의-Smt을 융합 태그 N-말단 배와 수정 pET28 벡터 시스템 (10)에 클로닝 하였다. 복제 워크 플로우의 개요는 그림 4에 표시됩니다. 성공적으로 복제 한 후 각 구조의 마이크로 스케일의 단백질 발현은 BL21 (DE3) E.에서 테스트되었습니다대장균 세포. 세포는 220 rpm에서 진탕 배양기 세트에 20 ° C에서 48 시간 동안 Novagen 사 익일 인 1 매체 (제조 업체의 프로토콜에 따라)로 보충 TB 배지에서 성장했다. 성장 후, 세포 캘리퍼스 LabChip 90 모세관 electrophoreses를 사용하여 수용성 단백질 발현을위한 수확 및 테스트되었습니다. 수용성 목적 단백질을 주도하고 서른 넷 PB2 구조의 열네 대규모 발효에 들어갔다. 각 구조의 대규모 배양 제조 업체의 프로토콜에 따라 Novagen 사의 하룻밤 익스프레스 1 매체와 보충 TB 배지에서 성장했다. 성장 후, 세포를 원심 분리를 통해 수확되었고, -80에 저장 ° C. 각 문화의 대규모 단백질 발현은 대규모 정화를 진행하기 전에 SDS-PAGE 분석 (그림 5)를 통해 확인 하였다. 단백질 메이커 열네 PB2 구조의 병렬 정제를 수행하는 데 사용되었다. 알의 명확히 해물내가 십사 구조는 니켈 - 킬레이트 칼럼을 통해 실행되었습니다. SDS-PAGE에 의해 표적 단백질을 포함하는 분획 결정한 후, 해당 분수는 각 샘플에 대한 풀링 된 각각의 농도는 280 독서에 의해 결정되었다. 배 그의-Smt 개의 태그 제거는 하룻밤 투석 두 번째 니켈 열 다음에 ULP1의 추가에 의해 실시되었다. 그의-Smt 개의 태그 제거의 확인은 SDS-PAGE (그림 6)에 의해 실시되었다, 각 샘플은 10 kDa의 Amicon 울트라 원심 분리 관에 집중되었다. Amicon 울트라 원심 분리기 튜브를 사용하여 농축 한 후, 각 샘플은 결정학 순도를 달성하기 위해 크기 조정 컬럼을 통해 실행되었습니다. 두 번째 농도는 결정화에 필요한 수준으로 단백질 농도를 높이기 위해 실시되었다. 모든 열네 구조가 성공적으로 정제 및 결정화 실험을 체결 하였다. 결정화 이전에 천을 해동에 의해 시작되었다OZEN 단백질. 결정은 16에서 기후 제어 방에서 수행되었다 ° C 앉아 드롭 증기 확산 (그림 7)를 위해 특별히 디자인 플레이트 (에메랄드 바이오)와 함께. 초기 심사 개의 스파 스 매트릭스 화면으로 실시되었다 JCSG +, 협정, 마법사 전체, 그리고 확장 뉴먼 전략에 따라 CryoFull (에메랄드 바이오). 단백질 용액 0.4 μL는 96 - 웰 컴팩트 주니어 결정 플레이트 (에메랄드 바이오)를 사용하여 해당 저장소에서 crystallant 0.4 μL (또는 저수지 용액)로 혼합 하였다. 열네 정제 시료의 그 아홉은 회절 연구 (그림 8)에 적합한 결정이 나왔고. 사내 회절 데이터 세트는 Osmic VARIMAX HF 광학 및 토성 944 + CCD 검출기가 장착 된 Rigaku SUPERBRIGHT FR-E + 회전 양극 X-선 발생기를 사용하여 구리 Kα 파장에서 결정 구 구조의 오 (그림 9에서 수집 된 ). 각 데이터 세트는 XDS / 엑스 스케일 4로 처리했다 &lt;<html> / 한모금&gt;와 최종 해상도로 확장. 분자 교체하여 구조를 해결하기 위해 시도 CCP4 스위트 7에서 페이저 5를 실시 하였다. 최종 모델은 REFMAC 7 검둥 오리 11의 수동 재 구축에 정제 한 후 하였다. 구조 평가 및 MolProbity 9 형상 및 피트니스에 대해 보정 하였다. PB2 subunit의 네 가지 구조의 총 결정 (그림 10)와 PDB로 입금되었다. 그림 11 MTPP 파이프 라인의 각 단계에서 전체 결과를 보여줍니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig1.jpg" /> 그림 1. 에메랄드 바이오시 멀티 타겟 병렬 처리를위한 SSGCID 유전자에 구조 통로의 개요. 내용 &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig2.jpg" /> 그림 2. 정렬 뷰어 및 단백질 유전자 Composer 소프트웨어의 설계 모듈을 구축합니다. 아미노산베이스 그린 (가운데 창) 및 대체 구문의 구조 유도 잘림이 금 (하단 창)에 표시됩니다에 표시되어 대상의 구성. 여러 독감 바이러스 PB2 서열 정렬이 순서와 이차 구조 요소에 비해 표시됩니다 PDBID 3CW4의 C-말단 도메인의. 도메인 구조 및 이차 구조 요소의 지식은 N-말단 잘림이 원하는 아미노산을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 유전자 작곡가 디자인 모듈 내에서 선택 할 수 있습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4225/4225fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 그림 3A. 파이프 복제는 합성 유전자 삽입 (오렌지)가 앞으로 디자인 (레드 오렌지 선)와 생성 역 (오렌지 블루 라인) 프라이머는 PCR 물질을 삽입하여 증폭되는 것을 특징으로 설명되어 있습니다. 발현 벡터가 반대 (빨강 - 검정 라인 증폭 ) 앞으로 (블루 블랙 라인) 프라이머 벡터 PCR 자료를 생성합니다. 터미널 시퀀스 IPCR 제품은 vPCR 제품 (IPCR의 붉은 IPCR의 vPCR와 블루 vPCR 블루 보완 빨간 보완)의 단자 시퀀스를 보완합니다. 이 IPCR 및 vPCR 제품은 호스트 BL21 (DE3) 화학적 관할 E.으로 변화에 복제되는 플라스미드를 형성 어닐링 할 수 있습니다 대장균 세포. <img alt="그림 3B" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig3b.jpg" /> 그림 3b. IPCR 생산의 영동 분석<html> 성공적인 IPCR 제품은 강력한 밴드로 표현하는 동안 PB2 소단위에서 TS. IPCR 실패는, 희미하거나 더럽혀진 밴드로 볼 수 있습니다. IPCR 제품의 품질은 일반적으로 복제의 성공과 상관 될 수 있습니다. 분자량 마커 kiloDaltons에 있습니다. 그림은 레이몬드 외., 2011 12에서 재생됩니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig4.jpg" /> 그림 4. 대상 유전자 공학 단계 PB2 단백질이 유전자 Composer 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다. 설계 핵산 서열이 각 대상에 대해 설립 후 6-7 다른 단백질 구조는 각 위해 설계되었습니다. 유전자 설계 및 복제의 초기 단계에있는 다중 표적 병렬 처리는 E.에 용해 단백질을 생산 가능한 대상이었다 14 어느 34 구조, 결과 대장균. <html> 다시 10 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4225/4225fig5.jpg &quot;/&gt; 그림 5. 강력한 단백질 발현 (25.76 kDa의의 예상 크기), (레인 7) 용출 된 단백질에서 배 그분-Smt을 (를) 태그의 분열을 약 50 %의 수용성 (레인 4)와 50 %를 보여주는 대규모 발효의 대표 SDS-PAGE 분석. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig6.jpg" /> 그림 6. 효소의 PB2 subunit의 세 가지 구조에 대한 SDS-PAGE 결과 레인 1, 분자량 마커 (kDa의의 왼쪽에 표시). 레인 2, 6, 10, 니켈 1 열에서 풀링 단백질, 레인 3, 7,과 11 니켈 2에서 버퍼에 쪼개진 단백질의 흐름을 통해, 레인 4, 8, 12, 니켈 2에서 버퍼 B에 배 그의-Smt 개의 태그를 제거. d/4225/4225fig7.jpg &quot;/&gt; 그림 7. 앉아있는 드롭 방법으로 수증기 확산의 개략도. 단백질 결정화 앉아 드롭 방법은 증기 확산의 범주에 속합니다. 이 방법은 단백질과 높은 농도에서 유사한 조건을 포함하는 큰 저수지와 평형하는 침전제의 정제 된 샘플을 수반한다. 물이 단백질 샘플 및 전송에서 저수지 증발로 침전 농도는 단백질 결정화에 대한 최적의 수준으로 증가합니다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig8.jpg" /> 그림 8. 인플루엔자 바이러스의 변형에서 효소의 PB2 소단위 단백질 크리스탈. <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig9.jpg" /> 그림 9. 에서 효소의 PB2 소단위의 X-선 회절 이미지인플루엔자 바이러스의 변형. <img alt="그림 10" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig10.jpg" /> 그림 10. 4 PB2 구조 결정학 비대칭 단위 분자의 리본 다이어그램. 해당 PDB 코드에 무지개의 패턴 컬러 차 구조. () 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (B) 3KHW (A / 멕시코 / InDRE4487/2009/H1N1) (C) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (D) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1). <img alt="그림 11" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4225/4225fig11.jpg" /> 그림 11. 설명 된 방법에 의한 인플루엔자 PB2 대상에 대한 결과 분석. structur에이전자 측정 파이프 라인은 다섯 단계에 설명되어 있습니다 : 복제, 용해도, 정제, 결정화 및 구조 결정.

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Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

구조 기반 약물 설계 약물 개발에 중요한 역할을한다. 병렬로 여러 대상을 추구하는 것은 크게 선 발견의 성공의 기회를 증가합니다. 다음 문서는 감염성 질환 시애틀 구조 유전체학 센터 PB2 인플루엔자 단위체의 유전자에 대한 구조 결정을위한 멀티 타겟 접근 방식을 활용하는 방법 강조한다.

인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질과 마우스 MX1 단백질의 공동 면역 침전

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

형광 기반의 뉴 라미니다 아제 억제 분석은 항 바이러스제의 뉴 라미니다 아제 억제제 클래스에 인플루엔자 바이러스의 감수성을 평가하기 위해

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...