Name: visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy
Uploaded: 2012-10-01T13:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier Richard Reste pour le don généreux de anthrolysin O, Michael Caparon pour le don généreux des Francs SLO plasmide et Jonathon d&#39;assistance technique. Ce travail a été financé par des subventions du NIH T32CA82084 (PAK), et R01AI072083 (RDS).

1. Purification de streptolysine O (SLO) <ol><li> Inoculer 20 ml de culture de nuit de cellules BL21 contenant le plasmide GOLD pBADgIII-SLOhis 9 dans 0,5 L de bouillon LB et ajouter 500 ul de 50 mg / ml d&#39;ampicilline. Secouez la culture à 225 rpm à 37 ° C jusqu&#39;à DO600 = 0,6, habituellement ~ 1,5 h. Centrifuger 1 ml (bactéries considérées T 0) à 10.000 xg 5 min, dissoudre le culot dans tampon 140 pi d&#39;échantillon SDS 1x / 1 OD et soniquer à l&#39;ADN de cisaillem...

<ol>
	<li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+regulates+IL-1+beta+processing+via+calcium-independent+phospholipase+A2.">Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2.</a> J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).</li><li>Scolding, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+removal+by+oligodendrocytes+of+membrane+attack+complexes+formed+by+activated+complement.">Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement.</a> Nature. 339, 620-622 (1989).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane.">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).</li><li>MacKenzie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+secretion+of+interleukin-1beta+by+microvesicle+shedding.">Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding.</a> Immunity. 15, 825-835 (2001).</li><li>Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+IL-1+beta+secretion+stimulated+by+P2X7+receptors+is+dependent+on+inflammasome+activation+and+correlated+with+exosome+release+in+murine+macrophages.">Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages.</a> J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).</li><li>Andrei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+C+and+A2+control+lysosome-mediated+IL-1+beta+secretion:+Implications+for+inflammatory+processes.">Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).</li><li>Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis.">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).</li><li>Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+cytolysin-mediated+translocation+does+not+require+pore+formation+by+streptolysin+O.">Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O.</a> EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).</li><li>Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thiol-activated+toxin+streptolysin+O+does+not+require+a+thiol+group+for+cytolytic+activity.">The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity.</a> Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).</li><li>Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+between+immune+cells+mediated+by+tunneling+nanotubules.">Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules.</a> Immunity. 23, 309-318 (2005).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+anthrolysin+O,+the+Bacillus+anthracis+cholesterol-dependent+cytolysin.">Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin.</a> Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).</li></ol>

Les techniques décrites ici permettent l&#39;examen des réponses des cellules immunitaires à des toxines bactériennes. L&#39;étape la plus critique est la manipulation et le dosage de la toxine. Activité de la toxine peut être extrêmement variable, même entre différentes aliquotes de la même préparation, en raison de sa fragilité. Cela nécessite soit l&#39;essai de chaque aliquote de la toxine contre une lignée cellulaire de référence ou globules rouges ou en utilisant des gradients de toxines. Gradient...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 </td><td></td></tr><tr><td> polymixine-agarose </td><td> Sigma </td><td> P1411-5ML </td><td></td></tr><tr><td> Zeba dessaler Spin col </td><td> Pêcheur </td><td> PI-89891 </td><td></td></tr><tr><td> hématies de mouton </td><td> Pêcheur </td><td> 50-415-688 </td><td></td></tr><tr><td> pBADgIII-SLO </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> voir ref 9 </td></tr><tr><td> Cy5 colorant monoréactif </td><td> GE Healthcare </td><td> PA25001 </td><td></td></tr><tr><td> Fura2-AM </td><td> Life Technologies </td><td> F1221 </td><td></td></tr><tr><td> Calcéine AM / Ethidium homodimère </td><td> Life Technologies </td><td> L3224 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD11c-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 550261 </td><td></td></tr><tr><td> revêtu de collagène à fond de verre plat </td><td> Mattek </td><td> P35GCol-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> femto-tip II </td><td> Pêcheur </td><td> E5242957000 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Pêcheur </td><td> E5242956003 </td><td></td></tr><tr><td> dextrane Alexa 555 </td><td> Life Technologies </td><td> D34679 </td><td></td></tr><tr><td> InjectMan NI 2 </td><td> Eppendorf </td><td> 920000029 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet </td><td> Eppendorf </td><td> 5247 000.013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Liste et source de réactifs spécifiques et des équipement nécessaire. Equipements spécifiques et les réactifs utilisés dans ce protocole, ainsi que la société et le numéro de catalogue sont répertoriés. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Tampon </td><td> Composition </td><td> Étape usagé </td></tr><tr><td> Lyse / Wash </td><td> 50 mM de NaH 2 PO 4 300 mM NaCl 10 mM d&#39;imidazole, pH 8,0 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> Tris / sel </td><td> Tris 50 mM, pH 8,0 300 mM NaCl </td><td> 1,7 </td></tr><tr><td> Tampon d&#39;élution </td><td> Tris 50 mM, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM d&#39;imidazole </td><td> 1,8 </td></tr><tr><td> Tampon de dosage RBC </td><td> 0,3% de BSA 2 mM de CaCl2 HEPES 10 mM, pH 7,4 </td><td> 2,1 </td></tr><tr><td> tampon R / B </td><td> Milieu de culture RPMI cellule 2 mM de CaCl2 0,5% de BSA </td><td&gt; 3,1 </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 2. Liste des tampons utilisés dans ce protocole. Les tampons utilisés, leur composition et de la première étape au cours de laquelle ils sont utilisés dans le protocole sont énumérés. </td></tr></tbody></table>

visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy

Toxines bactériennes se lier au cholestérol dans les membranes, en formant des pores qui permettent une fuite du contenu cellulaire et l&#39;afflux de matériaux provenant de l&#39;environnement extérieur. La cellule peut soit se remettre de cette insulte, ce qui nécessite actifs des processus de réparation des membranes, ou mourir en fonction de la quantité d&#39;exposition aux toxines et 1 type de cellule. En outre, ces toxines induisent de fortes réactions inflammatoires chez les hôtes infectés par l&#39;activation des cellules immunitaires, dont les macrophages, qui produisent une gamme de cytokines pro-inflammatoires 2. De nombreuses bactéries Gram-positives produisent des toxines cholestérol contraignants qui ont été montrés pour contribuer à leur virulence en grande partie grâce à des mécanismes non caractérisés. Des changements morphologiques dans la membrane plasmique des cellules exposées à ces toxines comprennent leur séquestration dans les protubérances de surface cholestérol enrichis, qui peuvent être versées dans l&#39;espace extracellulaire, ce qui suggère une défense cellulaire intrinsèqueMécanisme 3,4. Ce processus se produit sur ​​toutes les cellules en l&#39;absence de l&#39;activité métabolique, et peuvent être visualisées à l&#39;aide EM au bout de 4 fixation chimique. Dans les cellules immunitaires comme les macrophages, qui interviennent dans l&#39;inflammation en réponse à l&#39;exposition aux toxines, des vésicules membranaires induits sont suggérées pour contenir cytokines de la famille IL-1 et peut être responsable à la fois pour l&#39;excrétion des toxines et la diffusion de ces cytokines pro-inflammatoires 5,6,7. Un lien entre l&#39;IL-1β libération et un type spécifique de mort cellulaire, appelée pyroptosis a été suggéré, car les deux sont des processus caspase-1 dépendantes 8. Pour démêler les complexités de cette réponse des macrophages, ce qui inclut la liaison toxine, l&#39;excrétion de vésicules membranaires, la libération de cytokines et la mort cellulaire potentiellement, nous avons développé des techniques d&#39;étiquetage et les méthodes de microscopie par fluorescence qui permettent de visualiser en temps réel des toxines cellulaires des interactions, y compris mesures de dysfonctionnement et la mort (figure 1). Utiliserd&#39;imagerie des cellules vivantes est nécessaire en raison des limitations dans d&#39;autres techniques. Approches biochimiques ne peut pas résoudre effets qui se produisent dans des cellules individuelles, tout en cytométrie en flux n&#39;offre pas de haute résolution, visualisation en temps réel des cellules individuelles. Les méthodes décrites ici peuvent être appliqués à l&#39;analyse cinétique des réactions induites par des stimuli complexes impliquant d&#39;autres changements phénotypiques dans les cellules.

Typiquement 10 7 -10 8 U / ml SLO peut être obtenue avec une concentration en protéines de 4 mg / ml. La quantité de toxine nécessaire pour la lyse des cellules varie selon le type cellulaire, mais elle est généralement de 125 à 500 U / ml SLO (figure 2B). Types de cellules comme les macrophages peuvent être plus résistantes (4000 U / ml) alors que d&#39;autres (en particulier des lignées de cellules T) sont plus sensibles. Ces sensibilités correspondre avec SLO disponib...

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Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Méthodes de purification du cholestérol contraignant toxine streptolysine O de recombinaison<em&gt; E. coli</em&gt; Et la visualisation de liaison de la toxine à vivre cellules eucaryotes sont décrits. Application locale de la toxine induit des changements rapides et complexes dans les cellules ciblées révélant de nouveaux aspects de la biologie toxine.

Visualisation des réponses toxine bactérienne induite en utilisant direct microscopie de fluorescence cellulaire

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

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