Name: visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy
Uploaded: 2012-10-01T13:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare Richard Riposo per il dono generoso di anthrolysin O, Michael Caparon per il generoso dono dei Franchi SLO plasmide e Jonathon per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH sovvenzioni T32CA82084 (PAK), e R01AI072083 (RDS).

1. Purificazione di streptolisina O (SLO) <ol><li> Inoculare 20 ml di coltura overnight cellule BL21 ORO contenenti plasmide pBADgIII-SLOhis 9 in 0,5 L di brodo LB e aggiungere 500 microlitri 50 mg / ml ampicillina. Agitare coltura a 225 rpm a 37 ° C fino a OD 600 = 0,6, di solito ~ 1,5 hr. Centrifugare 1 batteri ml (considerato T 0) a 10.000 xg 5 minuti, sciogliere pellet in 140 microlitri 1x tampone campione SDS / 1 OD e sonicare al DNA di taglio per l&#39;analisi delle proteine ​...

<ol>
	<li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+regulates+IL-1+beta+processing+via+calcium-independent+phospholipase+A2.">Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2.</a> J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).</li><li>Scolding, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+removal+by+oligodendrocytes+of+membrane+attack+complexes+formed+by+activated+complement.">Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement.</a> Nature. 339, 620-622 (1989).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane.">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).</li><li>MacKenzie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+secretion+of+interleukin-1beta+by+microvesicle+shedding.">Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding.</a> Immunity. 15, 825-835 (2001).</li><li>Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+IL-1+beta+secretion+stimulated+by+P2X7+receptors+is+dependent+on+inflammasome+activation+and+correlated+with+exosome+release+in+murine+macrophages.">Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages.</a> J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).</li><li>Andrei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+C+and+A2+control+lysosome-mediated+IL-1+beta+secretion:+Implications+for+inflammatory+processes.">Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).</li><li>Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis.">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).</li><li>Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+cytolysin-mediated+translocation+does+not+require+pore+formation+by+streptolysin+O.">Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O.</a> EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).</li><li>Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thiol-activated+toxin+streptolysin+O+does+not+require+a+thiol+group+for+cytolytic+activity.">The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity.</a> Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).</li><li>Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+between+immune+cells+mediated+by+tunneling+nanotubules.">Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules.</a> Immunity. 23, 309-318 (2005).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+anthrolysin+O,+the+Bacillus+anthracis+cholesterol-dependent+cytolysin.">Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin.</a> Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).</li></ol>

Le tecniche qui descritte consentono l&#39;esame delle risposte delle cellule immunitarie di tossine batteriche. La fase più critica è la manipolazione e somministrazione della tossina. Attività tossina può essere estremamente variabile, anche tra differenti aliquote del preparato stesso, per la sua fragilità. Ciò richiede sia la prova di ogni aliquota di tossina contro una linea cellulare di riferimento o globuli rossi o utilizzando gradienti tossina. Gradienti di tossina, come espresso dal micropipetta, permetto...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarosio </td><td> Qiagen </td><td> 30210 </td><td></td></tr><tr><td> polimixina-agarosio </td><td> Sigma </td><td> P1411-5ML </td><td></td></tr><tr><td> Zeba desalt Spin col </td><td> Pescatore </td><td> PI-89891 </td><td></td></tr><tr><td> globuli rossi di pecora </td><td> Pescatore </td><td> 50-415-688 </td><td></td></tr><tr><td> pBADgIII-SLO </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> vedi rif 9 </td></tr><tr><td> Cy5 colorante monoreactive </td><td> GE Healthcare </td><td> PA25001 </td><td></td></tr><tr><td> Fura2-AM </td><td> Life Technologies </td><td> F1221 </td><td></td></tr><tr><td> Calcein AM / Ethidium omodimero </td><td> Life Technologies </td><td> L3224 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD11c-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 550261 </td><td></td></tr><tr><td> collagene rivestito con fondo di vetro piatto </td><td> Mattek </td><td> P35GCol-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> femto-tip II </td><td> Pescatore </td><td> E5242957000 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Pescatore </td><td> E5242956003 </td><td></td></tr><tr><td> destrano Alexa 555 </td><td> Life Technologies </td><td> D34679 </td><td></td></tr><tr><td> InjectMan NI 2 </td><td> Eppendorf </td><td> 920000029 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet </td><td> Eppendorf </td><td> 5247 000.013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Elenco e fonte di reagenti specifici e equipment necessario. Attrezzature e reagenti utilizzati in questo protocollo, insieme con l&#39;azienda e il numero di catalogo sono elencati. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Buffer </td><td> Composizione </td><td> Passo Usato </td></tr><tr><td> Lyse / lavaggio </td><td> 50 mM NaH 2 PO 4 300 mM NaCl Imidazolo 10 mM, pH 8,0 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> Tris / sale </td><td> 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl </td><td> 1,7 </td></tr><tr><td> Tampone di eluizione </td><td> 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM imidazolo </td><td> 1,8 </td></tr><tr><td> RBC Assay Buffer </td><td> 0,3% BSA 2 mM CaCl 2 HEPES 10 mM, pH 7,4 </td><td> 2,1 </td></tr><tr><td> buffer di R / B </td><td> Mezzo di coltura cellulare RPMI 2 mM CaCl 2 0,5% BSA </td><td&gt; 3.1 </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 2. Lista di buffer utilizzati in questo protocollo. I tamponi usati, la loro composizione e il primo passo in cui sono utilizzati nel protocollo sono elencati. </td></tr></tbody></table>

visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy

Tossine batteriche legano al colesterolo nelle membrane, formando pori che permettono la fuoriuscita di contenuto cellulare e afflusso di materiali dall&#39;ambiente esterno. La cella può recuperare da questo insulto, che richiede processi di riparazione membrane attive, oppure muoiono a seconda della quantità di esposizione tossina e tipo cellulare 1. Inoltre, queste tossine indurre forti risposte infiammatorie in host infetti attraverso l&#39;attivazione di cellule immunitarie, compresi i macrofagi, che producono una matrice di citochine pro-infiammatorie 2. Molti batteri Gram-positivi producono colesterolo vincolante tossine che hanno dimostrato di contribuire alla loro virulenza attraverso meccanismi in gran parte non ancora caratterizzati. Alterazioni morfologiche della membrana plasmatica di cellule esposte a tali tossine includere il sequestro in colesterolo arricchiti protuberanze superficiali, che può essere versato nello spazio extracellulare, suggerendo una difesa intrinseca cellulareMeccanismo 3,4. Questo processo si verifica in tutte le cellule in assenza di attività metabolica, e possono essere visualizzati utilizzando EM dopo 4 chimica fissazione. In cellule immunitarie quali macrofagi che mediano l&#39;infiammazione in risposta all&#39;esposizione tossina, vescicole di membrana indotte sono suggeriti per contenere citochine della famiglia IL-1 e può essere responsabile sia spargimento tossina e diffondere queste citochine pro-infiammatorie 5,6,7. Un collegamento tra IL-1β rilascio e un tipo specifico di morte cellulare, pyroptosis chiamato è stato suggerito, in quanto entrambi sono processi caspasi-1 8 dipendenti. Per risolvere la complessità di questa risposta dei macrofagi, che comprende vincolante tossina, spargimento di vescicole di membrana, rilascio di citochine, e la morte delle cellule potenzialmente, abbiamo sviluppato le tecniche di etichettatura e metodi di microscopia a fluorescenza che consentono la visualizzazione in tempo reale della tossina cellule interazioni, tra cui misurazioni di disfunzioni e morte (Figura 1). Utilizzaredi imaging cellulare dal vivo è necessario a causa di limiti di altre tecniche. Approcci biochimici non possono risolvere effetti che si verificano in cellule individuali, mentre citofluorimetria non offre alta risoluzione, visualizzazione in tempo reale delle singole celle. I metodi qui descritti possono essere applicati ad analisi cinetica delle risposte indotte da altri stimoli implicano complesse variazioni fenotipiche nelle cellule.

Tipicamente 10 7 -10 8 U / ml SLO può essere ottenuta con una concentrazione proteica di 4 mg / ml. La quantità di tossina necessaria per lisi cellulare varia con il tipo cellulare, ma di solito è 125-500 U / ml SLO (Figura 2B). Tipi di cellule, come macrofagi può essere più resistenti (4000 U / ml) se altri (linee cellulari T specialmente) sono più sensibili. Queste sensibilità corrispondono SLO disponibile in commercio. Tossina attività diminuisce di circa 2 volte con ogn...

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Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Metodi per purificare il colesterolo vincolante tossina streptolisina O ricombinante da<em&gt; E. coli</em&gt; E visualizzazione di tossina legarsi a vivere cellule eucariotiche sono descritti. Erogazione localizzata di tossina induce cambiamenti rapidi e complessi nelle cellule bersaglio che rivelano nuovi aspetti della biologia tossina.

Visualizzazione delle risposte tossina batterica provocata con diretta microscopia a fluorescenza cellulare

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

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Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

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Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

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Misurare risposte fisiologiche di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni sensoriali a Lipid feromoni utilizza Live Calcio Imaging

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Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

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