Name: visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy
Uploaded: 2012-10-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

著者は、技術支援のSLOプラスミドとジョナサンフランクスの寛大な贈り物のためにanthrolysin O、マイケルCaparonの寛大な贈り物をリチャードレストに感謝したいと思います。この作品は、NIHの助成T32CA82084（PAK）とR01AI072083（RDS）によって賄われていた。

1。ストレプトリジンO（SLO）の精製<ol><li> 0.5LのLBブロスにプラスミドpBADgIII SLOhis-9を含むBL21 GOLDの細胞を20mlの一晩培養物を接種し、500μlの50 mg / mlのアンピシリンを追加します。 37℃で225rpmで振とう培養し、OD 600 = 0.6になるまでには、通常1.5時間を〜。 10,000 5分xgで1 mlの細菌（T 0と見なされます）遠心し、140μlの1×SDSサンプルバッファー/ 1 ODでペレットを溶解し、タ?...

<ol>
	<li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+regulates+IL-1+beta+processing+via+calcium-independent+phospholipase+A2.">Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2.</a> J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).</li><li>Scolding, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+removal+by+oligodendrocytes+of+membrane+attack+complexes+formed+by+activated+complement.">Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement.</a> Nature. 339, 620-622 (1989).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane.">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).</li><li>MacKenzie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+secretion+of+interleukin-1beta+by+microvesicle+shedding.">Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding.</a> Immunity. 15, 825-835 (2001).</li><li>Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+IL-1+beta+secretion+stimulated+by+P2X7+receptors+is+dependent+on+inflammasome+activation+and+correlated+with+exosome+release+in+murine+macrophages.">Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages.</a> J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).</li><li>Andrei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+C+and+A2+control+lysosome-mediated+IL-1+beta+secretion:+Implications+for+inflammatory+processes.">Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).</li><li>Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis.">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).</li><li>Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+cytolysin-mediated+translocation+does+not+require+pore+formation+by+streptolysin+O.">Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O.</a> EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).</li><li>Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thiol-activated+toxin+streptolysin+O+does+not+require+a+thiol+group+for+cytolytic+activity.">The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity.</a> Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).</li><li>Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+between+immune+cells+mediated+by+tunneling+nanotubules.">Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules.</a> Immunity. 23, 309-318 (2005).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+anthrolysin+O,+the+Bacillus+anthracis+cholesterol-dependent+cytolysin.">Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin.</a> Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).</li></ol>

技術は細菌毒素に対する免疫細胞の反応の検査を可能にする、ここで説明。最も重要なステップは、毒素の取り扱いと投薬です。毒素活性はさらにそのもろさのために、同じ製剤の異なるアリコートの間、非常に可変にすることができます。これは、いずれかの基準セルラインや赤血球に対する毒素の各アリコートをテストする、または毒素のグラデーションを使用する必要が生じて。毒素?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> Ni-NTAアガロース</td><td>キアゲン</td><td> 30210 </td><td></td></tr><tr><td>ポリミキシン-アガロース</td><td>シグマ</td><td> P1411-5ML </td><td></td></tr><tr><td> Zeba脱塩スピンCOL </td><td>フィッシャー</td><td> PI-89891 </td><td></td></tr><tr><td>ヒツジ赤血球</td><td>フィッシャー</td><td> 50-415-688 </td><td></td></tr><tr><td> pBADgIII-SLO </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> refは9を参照してください</td></tr><tr><td> Cy5の単反応性染料</td><td> GEヘルスケア</td><td> PA25001 </td><td></td></tr><tr><td> Fura2-AM </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> F1221 </td><td></td></tr><tr><td>カルセインAM / EThidiumホモダイマー</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> L3224 </td><td></td></tr><tr><td>抗CD11c-APC </td><td> BD Biosciences社</td><td> 550261 </td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンコートガラスボトムディッシュ</td><td>マテック</td><td> P35GCol-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td>フェムト先端II </td><td>フィッシャー</td><td> E5242957000 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader </td><td>フィッシャー</td><td> E5242956003 </td><td></td></tr><tr><td>デキストランアレクサ555 </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> D34679 </td><td></td></tr><tr><td> Injectman NI 2 </td><td>エッペンドルフ</td><td> 920000029 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet </td><td>エッペンドルフ</td><td> 5247 000.013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>特定の試薬 ​​および設備を導入の表1。リストとソースENTが必要。会社とカタログ番号と一緒に、このプロトコルで使用される特定の機器や試薬は、記載されています。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> バッファ </td><td> 構図 </td><td> 使用されるステップ </td></tr><tr><td>溶解/洗浄</td><td>の50mMのNaH 2 PO 4 300mMのNaCl 10mMイミダゾール、pH8.0の</td><td> 1.4 </td></tr><tr><td>トリス/塩</td><td> 50mMのトリス、pH8.0 300mMのNaCl </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td>溶出緩衝液</td><td> 50mMのトリス、pH8.0 300mMのNaCl 250mMイミダゾール</td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> RBCアッセイバッファー</td><td> 0.3パーセントのBSA 2mMのCaCl 2 10mMのHEPES、pH7.4の</td><td> 2.1 </td></tr><tr><td>バッファR / B </td><td> RPMI培地細胞培養培地 2mMのCaCl 2 0.5％BSA </td><tD&gt; 3.1 </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>このプロトコルで使用されるバッファの表2。一覧。使用されるバッファは、その組成とは、プロトコルで使用されるときの最初のステップが記載されています。 </td></tr></tbody></table>

visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy

細菌毒素は、細胞内容物と外部環境からの物質の流入の漏洩を可能に孔を形成し、膜中のコレステロールと結合する。セルは、アクティブ膜修復プロセスを必要とするこの侮辱から回復、または他の毒素曝露や細胞タイプ1の量に応じて、死ぬことができます。さらに、これらの毒素は、炎症性サイトカインの配列2を産生するマクロファージなどの免疫細胞の活性化を介して感染したホスト内の強い炎症反応を誘導する。多くのグラム陽性菌は、主に特徴づけられていないメカニズムを介してそれらの病原性に寄与することが示されているコレステロール結合毒素を産生する。 これらの毒素に曝露した細胞の形質膜における形態学的変化は本質的な細胞防御を示唆し、細胞外空間に流すことができ、コレステロールに富んだ表面突起、に彼らの隔離を含む機構3,4。このプロセスは、代謝活性の不在下で、すべてのセルで発生し、化学的固定4の後にEMを使用して可視化することができる。そのような毒素曝露に応答して炎症を媒介マクロファージなどの免疫細胞は、誘導される膜小胞はIL-1ファミリーのサイトカインを含むことが示唆されており、毒素を流し、これらの炎症性サイトカイン5,6,7を広めるための両方の責任があるかもしれません。両方とも8カスパーゼ1依存プロセスであるとして、IL-1β放出および細胞死の特定の種類の間にリンクと呼ばれるpyroptosisが、示唆されている。膜小胞の毒素結合、脱粒、サイトカイン放出、および潜在的に細胞死を含むこのマクロファージ応答の複雑さを整理するために、我々には、毒素 - 細胞間の相互作用のリアルタイム可視化を可能にラベリング手法や蛍光顕微鏡法を開発した機能不全と死の測定（ 図1）。使用ライブセルイメージングの他の技術の制限のために必要です。フローサイトメトリーは、個々の細胞の高分解能、リアルタイム可視化を提供していないながら、生化学的アプローチは、個々の細胞で発生する効果を解決することはできません。ここで説明する方法は、細胞内の複雑な表現型の変化を伴うその他の刺激によって誘導される応答の動態解析に適用することができます。

典型的には10 7〜10 8 U / mlのSLOは4 mg / mlのタンパク質濃度を求めることができる。細胞溶解に必要な毒素の量は、細胞の種類によって異なりますが、通常125から500 U / mlのSLO（ 図2B）です。他人（特にT細胞株）は、より敏感であるけれどもマクロファージ様細胞型（4000 U / ml）を、より耐性があることができます。これらの感応度は市販のSLOに対応しています。毒素活性は?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

組換え体からコレステロール結合毒素ストレプトリジンOの精製方法<em&gt; E大腸菌の</em真核細胞を生きるためにバインド毒素の&gt;と可視化が記載されている。毒素の局所送達は、毒素の生物学の新たな側面を明らかに標的細胞における迅速かつ複雑な変化を誘導する。

ライブセル蛍光顕微鏡を用いた細菌毒素誘導される応答の可視化

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

全葉のイメージングを使用して細菌細胞をライブに気孔反応を評価する

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

牛にエフェクターおよびメモリーT細胞応答を評価するための長期培養インターフェロンγ酵素結合免疫アッセイの応用

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

の生理反応を測定します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ライブカルシウムイメージングを使用して脂質フェロモンの感覚ニューロン

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...