Name: visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy
Uploaded: 2012-10-01T13:00:00
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저자는 기술 지원을 SLO 플라스미드와 조나단 프랭크의 관대 한 선물 anthrolysin O, 마이클 Caparon의 관대 한 선물 리처드 휴식을 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 T32CA82084 (박), 그리고 R01AI072083 (RDS)에 의해 재정 지원되었다.

1. Streptolysin O의 정화 (SLO) <ol><li> 0.5 L의 LB의 국물에 플라스미드 pBADgIII-SLOhis 9 포함 BL21 GOLD 세포의 20 ML 밤 문화의 예방 500 μl 50 MG / ML 암피실린을 추가합니다. 37 ° C에서 225 rpm으로 문화를 흔들어 OD 600까지 = 0.6은, 보통 1.5 시간을 ~. 10,000 5 분 XG에서 1 ML 박테리아를 (T 0으로 간주) 원심 분리기, 140 μl 1X SDS 샘플 버퍼 / 1 OD에서 펠렛을 분해하고 단백질 순도 분석에 전단 DNA에 s...

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	<li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+regulates+IL-1+beta+processing+via+calcium-independent+phospholipase+A2.">Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2.</a> J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).</li><li>Scolding, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+removal+by+oligodendrocytes+of+membrane+attack+complexes+formed+by+activated+complement.">Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement.</a> Nature. 339, 620-622 (1989).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane.">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).</li><li>MacKenzie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+secretion+of+interleukin-1beta+by+microvesicle+shedding.">Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding.</a> Immunity. 15, 825-835 (2001).</li><li>Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+IL-1+beta+secretion+stimulated+by+P2X7+receptors+is+dependent+on+inflammasome+activation+and+correlated+with+exosome+release+in+murine+macrophages.">Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages.</a> J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).</li><li>Andrei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+C+and+A2+control+lysosome-mediated+IL-1+beta+secretion:+Implications+for+inflammatory+processes.">Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).</li><li>Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis.">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).</li><li>Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+cytolysin-mediated+translocation+does+not+require+pore+formation+by+streptolysin+O.">Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O.</a> EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).</li><li>Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thiol-activated+toxin+streptolysin+O+does+not+require+a+thiol+group+for+cytolytic+activity.">The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity.</a> Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).</li><li>Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+between+immune+cells+mediated+by+tunneling+nanotubules.">Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules.</a> Immunity. 23, 309-318 (2005).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+anthrolysin+O,+the+Bacillus+anthracis+cholesterol-dependent+cytolysin.">Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin.</a> Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).</li></ol>

기술은 박테리아 독소에 대한 면역 세포의 반응을 시험 할 수 여기에 설명했다. 가장 중요한 단계는 독소의 처리와 주입합니다. 독소 활동도의 취약성으로 인해 같은 준비의 다른 aliquots 사이에 매우 변수가 될 수 있습니다. 이 중 참조 셀 라인 또는 적혈구에 대한 독소의 각 나누어지는을 테스트하거나 독소의 그라디언트를 사용하여 필요로. 독소 그라디언트는 등 micropipette에 의해 전달, 실시간?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 니켈 NTA 아가로 오스 </td><td> Qiagen </td><td> 30,210 </td><td></td></tr><tr><td> polymixin - 아가로 오스 </td><td> 시그마 </td><td> P1411-5ML </td><td></td></tr><tr><td> Zeba 탈염하다 스핀 컬럼 </td><td> 어부 </td><td> PI-89891 </td><td></td></tr><tr><td> 양 적혈구 </td><td> 어부 </td><td> 50-415-688 </td><td></td></tr><tr><td> pBADgIII-SLO </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 심판이 9 참조 </td></tr><tr><td> Cy5 monoreactive 염료 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> PA25001 </td><td></td></tr><tr><td> Fura2-AM </td><td> 생명 기술 </td><td> F1221 </td><td></td></tr><tr><td> Calcein AM / 장군님hidium homodimer </td><td> 생명 기술 </td><td> L3224 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 CD11c-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 550261 </td><td></td></tr><tr><td> 콜라겐 - 코팅 유리 바닥 요리 </td><td> Mattek </td><td> P35GCol - 1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> 펨토 - 팁 II </td><td> 어부 </td><td> E5242957000 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader </td><td> 어부 </td><td> E5242956003 </td><td></td></tr><tr><td> dextran 알렉사 555 </td><td> 생명 기술 </td><td> D34679 </td><td></td></tr><tr><td> Injectman NI이 </td><td> Eppendorf </td><td> 920000029 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet </td><td> Eppendorf </td><td> 5247 000.013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 특정 시약 및 equipm의 표 1. 목록 및 소스다닐이 필요 해요. 회사 카탈로그 번호와 함께이 프로토콜에서 사용되는 특정 장비와 시약이 나열되어 있습니다. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 버퍼 </td><td> 구성 </td><td> 사용 단계 </td></tr><tr><td> 세탁 / Lyse </td><td> 50 ㎜ 아뇨 2 PO 4 300 MM NaCl 10 MM 이미 다졸, pH를 8.0 </td><td> 1.4 </td></tr><tr><td> 트리스 / 소금 </td><td> 50 ㎜ 트리스, 산도 8.0 300 MM NaCl </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td> 용출 버퍼 </td><td> 50 ㎜ 트리스, 산도 8.0 300 MM NaCl 250 MM 이미 다졸 </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> RBC 분석 버퍼 </td><td> 0.3 % BSA 이 MM CaCl 2 10 MM HEPES, pH를 7.4 </td><td> 2.1 </td></tr><tr><td> 버퍼 R / B </td><td> RPMI 세포 배양액 이 MM CaCl 2 0.5 % BSA </td><tD&gt; 3.1 </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 이 프로토콜에 사용되는 버퍼의 표 2. 목록입니다. 사용되는 버퍼는 자신의 구성과 그들이 프로토콜에 사용되는에있는 첫 번째 단계가 나열됩니다. </td></tr></tbody></table>

visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy

세균 독소는 세포 내용과 외부 환경으로부터 물질의 유입을 누설 할 수 있도록 모공을 형성 세포막에 콜레스테롤에 바인딩. 셀은 운영 중 막 복구 프로세스가 필요합니다이 모욕, 복구, 또는 다른 독소 노출과 셀 타입 1의 양에 따라 죽을 수 있습니다. 또한 이러한 독소는 프로 염증성 크린 시토 킨 2 배열을 생산 식세포 등의 면역 세포의 활성화를 통해 감염된 호스트에 강한 염증 반응을 유도. 대부분의 그람 양성 세균은 대부분 uncharacterized 메커니즘을 통해 독성에 기여하는 표시되었습니다 콜레스테롤 구속력이 독소를 생성합니다. 이러한 독소에 노출 세포의 플라즈마 막에 Morphologic 변화는 본질적인 세포 방어를 제안, 세포 공간으로 발산 할 수 있습니다 콜레스테롤 강화 표면 돌기들에 대한 자신의 격리를 포함메커니즘 3,4. 이 과정은 신진 대사 활동의 부재에있는 모든 세포에서 발생, 화학 고정 (4) 후 EM을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 이러한 독소 노출에 대한 응답으로 염증을 중재 대 식세포와 같은 면역 세포에서 유도 막 소포는 IL-1 가족의 크린 시토 킨를 포함하도록 제안하고 독소를 흘리는 이러한 프로 염증성 크린 시토 킨 5,6,7을 전파 모두에 책임이있을 수 있습니다. 모두 8 caspase-1에 의존 프로세스입니다으로 IL-1β 자료 및 세포 죽음의 특정 유형 사이의 링크를 칭했다 pyroptosis이 제안되었습니다. 막 소포의 독소 바인딩, 개구, 시토 킨 릴리스, 그리고 잠재적으로 세포 사망을 포함이 대 식세포 반응의 복잡성을 해결하기 위해, 우리는 다음과 같은 독소 세포의 상호 작용 실시간으로 시각화 할 수 있도록 라벨 기술과 형광 현미경 방법을 개발 장애와 죽음의 측정 (그림 1). 사용라이브 셀 이미징의 다른 기술의 한계로 인해이 필요합니다. 유동 세포 계측법은 개별 세포의 고해상도, 실시간 시각화를 제공하지 않습니다 동안 생화학 접근 방법은 개별 셀에서 발생하는 효과를 확인할 수 없습니다. 여기에 설명 된 방법은 세포에서 복잡한 phenotypic 변화를 포함하는 다른 자극에 의​​해 유도 반응의 운동 분석에 적용 할 수 있습니다.

일반적으로 10 7 -10 8 U / ML SLO은 4 MG / ML의 단백질 농도를 구할 수 있습니다. 세포 용해에 필요한 독소의 양이 세포 유형에 따라 다르며, 보통 125-500 U / ML SLO (그림 2B)입니다. 다른 사람들이 (특히 T 세포 라인) 더 민감하지만 식세포와 같은 세포 유형 (4,000 U / ML) 더 내성이 될 수 있습니다. 이러한 민감한 상업적으로 사용할 수 SLO와 일치합니다. 독소 활동은 독소의 각 배?...

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Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

재조합에서 콜레스테롤 바인딩 독소 streptolysin O를 정화하기위한 방법<em&gt; E. 대장균</em진핵 세포를 사는 바인딩 독소&gt; 및 시각화가 설명되어 있습니다. 독소의 현지화 배달 독소 생물학의 소설 측면을 드러내는 대상 셀에 신속하고 복잡한 변화를 유도한다.

라이브 세포 형광 현미경을 사용하여 박테리아 독소 유도 응답의 시각화

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

연구

면역학 및 감염병학

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

곰팡이 병원체 Phagocytosis의 라이브 셀 비디오 현미경

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Application of Long-term cultured Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

소에 이펙터 및 메모리 T 세포 반응을 평가하기위한 장기 배양 인터페론-γ 효소 링크 된 Immunospot 분석의 응용 프로그램

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

의 생리적 반응을 측정<em&gt; 초파리</em&gt; 라이브 칼슘 이미징을 사용하여 지질 페로몬에 감각 뉴런

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...