Name: visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy
Uploaded: 2012-10-01T13:00:00
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Los autores desean agradecer a Richard Rest por el generoso regalo de anthrolysin O, Michael Caparon por el don generoso de los francos SLO plásmido y Jonathon de asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones T32CA82084 (PAK), y R01AI072083 (RDS).

1. Purificación de la estreptolisina O (SLO) <ol><li> Inocular 20 ml de cultivo durante la noche de células BL21 oro que contenía el plásmido pBADgIII SLOhis-9 en caldo LB 0,5 L y añadir 500 l 50 mg / ml de ampicilina. Agitar cultivo a 225 rpm a 37 ° C hasta OD 600 = 0,6, normalmente ~ 1,5 h. Centrifugar 1 ml de bacterias (considerados T 0) a 10.000 xg 5 min, se disuelve el pellet en 140 l 1x tampón de muestra de SDS / OD 1 y sonicado para ADN de cizallamiento para el análisis ...

<ol>
	<li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+regulates+IL-1+beta+processing+via+calcium-independent+phospholipase+A2.">Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2.</a> J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).</li><li>Scolding, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+removal+by+oligodendrocytes+of+membrane+attack+complexes+formed+by+activated+complement.">Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement.</a> Nature. 339, 620-622 (1989).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane.">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).</li><li>MacKenzie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+secretion+of+interleukin-1beta+by+microvesicle+shedding.">Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding.</a> Immunity. 15, 825-835 (2001).</li><li>Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+IL-1+beta+secretion+stimulated+by+P2X7+receptors+is+dependent+on+inflammasome+activation+and+correlated+with+exosome+release+in+murine+macrophages.">Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages.</a> J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).</li><li>Andrei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+C+and+A2+control+lysosome-mediated+IL-1+beta+secretion:+Implications+for+inflammatory+processes.">Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).</li><li>Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis.">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).</li><li>Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+cytolysin-mediated+translocation+does+not+require+pore+formation+by+streptolysin+O.">Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O.</a> EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).</li><li>Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thiol-activated+toxin+streptolysin+O+does+not+require+a+thiol+group+for+cytolytic+activity.">The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity.</a> Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).</li><li>Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+between+immune+cells+mediated+by+tunneling+nanotubules.">Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules.</a> Immunity. 23, 309-318 (2005).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+anthrolysin+O,+the+Bacillus+anthracis+cholesterol-dependent+cytolysin.">Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin.</a> Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).</li></ol>

Las técnicas aquí descritas permiten el examen de las respuestas de las células inmunes a las toxinas bacterianas. El paso más crítico es el manejo y la dosificación de la toxina. Actividad de la toxina puede ser muy variables, incluso entre diferentes alícuotas de la misma preparación, debido a su fragilidad. Esto requiere ya sea probando cada parte alícuota de toxina contra una línea celular de referencia o glóbulos rojos o el uso de gradientes de toxina. Gradientes de toxina, como entregado por micropipeta...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarosa </td><td> Qiagen </td><td> 30210 </td><td></td></tr><tr><td> polimixina-agarosa </td><td> Sigma </td><td> P1411-5ML </td><td></td></tr><tr><td> Zeba desalar spin columna </td><td> Pescador </td><td> PI-89891 </td><td></td></tr><tr><td> Los glóbulos rojos de oveja </td><td> Pescador </td><td> 50-415-688 </td><td></td></tr><tr><td> pBADgIII-SLO </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> ver nota 9 </td></tr><tr><td> Cy5 tinte monorreactivo </td><td> GE Healthcare </td><td> PA25001 </td><td></td></tr><tr><td> Fura2-AM </td><td> Life Technologies </td><td> F1221 </td><td></td></tr><tr><td> Calceína AM / EThidium homodímero </td><td> Life Technologies </td><td> L3224 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD11c-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 550261 </td><td></td></tr><tr><td> colágeno recubierto con fondo de cristal plato </td><td> Mattek </td><td> P35GCol-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> femto-tip II </td><td> Pescador </td><td> E5242957000 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Pescador </td><td> E5242956003 </td><td></td></tr><tr><td> dextrano Alexa 555 </td><td> Life Technologies </td><td> D34679 </td><td></td></tr><tr><td> InjectMan NI 2 </td><td> Eppendorf </td><td> 920000029 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet </td><td> Eppendorf </td><td> 5247 000.013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 1. Lista y fuente de los reactivos específicos y Equipment necesario. Equipos y reactivos utilizados en este protocolo, junto con la empresa y el número de catálogo se enumeran. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Buffer </td><td> Composición </td><td> Paso Usado </td></tr><tr><td> Lyse / Wash </td><td> 50 mM NaH 2 PO 4 300 mM NaCl 10 mM de imidazol, pH 8,0 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> Tris / sal </td><td> 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl </td><td> 1,7 </td></tr><tr><td> Tampón de elución </td><td> 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM de imidazol </td><td> 1,8 </td></tr><tr><td> RBC tampón de ensayo </td><td> 0,3% de BSA 2 mM CaCl 2 10 mM HEPES, pH 7,4 </td><td> 2,1 </td></tr><tr><td> tampón de R / B </td><td> Células RPMI medio de cultivo 2 mM CaCl 2 0,5% de BSA </td><td&gt; 3,1 </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 2. Lista de los tampones utilizados en este protocolo. Los tampones usados, su composición y el primer paso en el que se utilizan en el protocolo se enumeran. </td></tr></tbody></table>

visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy

Las toxinas bacterianas se unen al colesterol en las membranas, la formación de poros que permiten la fuga del contenido celular y el flujo de los materiales desde el entorno externo. La célula o bien puede recuperarse de este insulto, que requiere procesos activos de reparación de la membrana, o morir en función de la cantidad de exposición a la toxina y tipo de célula 1. Además, estas toxinas inducir fuertes respuestas inflamatorias en los huéspedes infectados a través de la activación de células inmunes, incluyendo los macrófagos, que producen una variedad de citoquinas pro-inflamatorias 2. Muchas bacterias Gram positivas producir colesterol toxinas vinculantes que se ha demostrado que contribuyen a su virulencia a través de mecanismos en gran medida no caracterizadas. Cambios morfológicos en la membrana plasmática de las células expuestas a estas toxinas incluyen su secuestro en salientes superficiales enriquecidos en colesterol, que puede liberarse en el espacio extracelular, lo que sugiere una defensa celular intrínsecamecanismo de 3,4. Este proceso se produce en todas las células en ausencia de actividad metabólica, y puede ser visualizado usando EM después de 4 fijación química. En las células inmunes, tales como macrófagos, que median la inflamación en respuesta a la exposición a la toxina, inducidos vesículas de membrana se sugieren para contener las citoquinas de la familia IL-1 y puede ser responsable tanto por derramar la toxina y la difusión de estas citoquinas pro-inflamatorias 5,6,7. Un enlace entre la IL-1β de liberación y un tipo específico de la muerte celular, denominado pyroptosis ha sugerido, ya que ambos son procesos que dependen de la caspasa-1 8. Para resolver la complejidad de esta respuesta de los macrófagos, que incluye la unión toxina, el desprendimiento de las vesículas de membrana, la liberación de citoquinas, y la muerte potencialmente celular, se han desarrollado técnicas de etiquetado y los métodos de microscopía de fluorescencia que permiten la visualización en tiempo real de las interacciones célula-toxina, incluyendo mediciones de la disfunción y la muerte (Figura 1). Utilizarde imágenes de células vivas es necesario debido a las limitaciones en otras técnicas. Enfoques bioquímicos no puede resolver los efectos que ocurren en células individuales, mientras que la citometría de flujo no ofrece alta resolución, en tiempo real la visualización de células individuales. Los métodos descritos aquí se pueden aplicar a análisis de la cinética de las respuestas inducidas por otros estímulos que implican complejos cambios fenotípicos en las células.

Típicamente 10 7 -10 8 U / ml SLO puede obtenerse con una concentración de proteína de 4 mg / ml. La cantidad de toxina requerida para la lisis celular varía según el tipo de célula, pero generalmente es 125-500 U / ml SLO (Figura 2B). Tipos de células como los macrófagos pueden ser más resistentes (4000 U / ml), aunque otros (especialmente líneas celulares T) son más sensibles. Estas sensibilidades corresponden con SLO disponible comercialmente. Actividad de la toxina d...

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Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Los métodos para purificar el colesterol unión toxina estreptolisina O de recombinante<em&gt; E. coli</em&gt; Y la visualización de la unión de la toxina a vivir las células eucariotas se describen. Entrega localizada de la toxina induce cambios rápidos y complejos en células específicas que revelan nuevos aspectos de la biología de la toxina.

La visualización de las respuestas inducidas por toxinas bacterianas mediante microscopía de fluorescencia de células en vivo

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Research

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Immunology and Infection

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