Name: visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy
Uploaded: 2012-10-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Författarna vill tacka Richard Rest for the generösa gåva anthrolysin O, Michael Caparon för generös gåva av SLO plasmid och Jonathon frankerna för tekniskt bistånd. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag T32CA82084 (PAK) och R01AI072083 (RDS).

1. Rening av streptolysin O (SLO) <ol><li> Inokulera 20 ml nattgammal kultur av BL21 GOLD celler innehållande pBADgIII-SLOhis plasmiden 9 i 0,5 L LB-buljong och tillsätt 500 pl 50 mg / ml ampicillin. Skaka kultur vid 225 rpm vid 37 ° C tills OD 600 = 0,6, vanligtvis ~ 1,5 timmar. Centrifugera 1 ml bakterier (anses T 0) vid 10.000 xg 5 minuter, lös pelleten i 140 ul 1x SDS provbuffert / 1 OD och sonikera att klippa DNA för protein renhet analys. </li><li> Inducera bakterier med til...

<ol>
	<li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+regulates+IL-1+beta+processing+via+calcium-independent+phospholipase+A2.">Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2.</a> J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).</li><li>Scolding, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+removal+by+oligodendrocytes+of+membrane+attack+complexes+formed+by+activated+complement.">Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement.</a> Nature. 339, 620-622 (1989).</li><li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane.">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).</li><li>MacKenzie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+secretion+of+interleukin-1beta+by+microvesicle+shedding.">Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding.</a> Immunity. 15, 825-835 (2001).</li><li>Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclassical+IL-1+beta+secretion+stimulated+by+P2X7+receptors+is+dependent+on+inflammasome+activation+and+correlated+with+exosome+release+in+murine+macrophages.">Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages.</a> J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).</li><li>Andrei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipases+C+and+A2+control+lysosome-mediated+IL-1+beta+secretion:+Implications+for+inflammatory+processes.">Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).</li><li>Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis.">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).</li><li>Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+cytolysin-mediated+translocation+does+not+require+pore+formation+by+streptolysin+O.">Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O.</a> EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).</li><li>Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thiol-activated+toxin+streptolysin+O+does+not+require+a+thiol+group+for+cytolytic+activity.">The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity.</a> Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).</li><li>Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+between+immune+cells+mediated+by+tunneling+nanotubules.">Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules.</a> Immunity. 23, 309-318 (2005).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+anthrolysin+O,+the+Bacillus+anthracis+cholesterol-dependent+cytolysin.">Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin.</a> Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).</li></ol>

De tekniker som beskrivs här tillåta undersökning av svaren från immunceller till bakteriella toxiner. Det mest kritiska steget är hantering och dosering av toxinet. Toxinaktivitet kan vara extremt varierande, även mellan olika alikvoter av samma beredning, på grund av dess bräcklighet. Detta kräver antingen testa varje alikvot av toxin mot en referens cellinje eller RBC eller använda toxin gradienter. Toxin gradienter, som levereras av mikropipett, låt hela spektrumet av toxin-inducerade aktiviteter som skal...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namnet av reagenset </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> Ni-NTA-agaros </td><td> Qiagen </td><td> 30.210 </td><td></td></tr><tr><td> polymixin-agaros </td><td> Sigma </td><td> P1411-5ML </td><td></td></tr><tr><td> Zeba avsalta Spin Col </td><td> Fisher </td><td> PI-89.891 </td><td></td></tr><tr><td> får röda blodkroppar </td><td> Fisher </td><td> 50-415-688 </td><td></td></tr><tr><td> pBADgIII-SLO </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> se ref 9 </td></tr><tr><td> Cy5 monoreactive färg </td><td> GE Healthcare </td><td> PA25001 </td><td></td></tr><tr><td> Fura2-AM </td><td> Life Technologies </td><td> F1221 </td><td></td></tr><tr><td> Kalcein AM / EtaOhidium homodimer </td><td> Life Technologies </td><td> L3224 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD11c-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 550.261 </td><td></td></tr><tr><td> kollagen-belagt glas-bottom maträtt </td><td> Mattek </td><td> P35GCol-1.5-10-C- </td><td></td></tr><tr><td> femto-tip II </td><td> Fisher </td><td> E5242957000 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Fisher </td><td> E5242956003 </td><td></td></tr><tr><td> dextran Alexa 555 </td><td> Life Technologies </td><td> D34679 </td><td></td></tr><tr><td> Injectman NI 2 </td><td> Eppendorf </td><td> 920000029 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet </td><td> Eppendorf </td><td> 5247 000.013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell 1. List och källa av specifika reagens och equipment behövs. Särskild utrustning och reagenser som används i detta protokoll, tillsammans med företaget och katalognummer listas. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Buffert </td><td> Sammansättning </td><td> Steg Bilar </td></tr><tr><td> Lyse / Tvätt </td><td> 50 mM NaH 2 PO 4 300 mM NaCl 10 mM imidazol, pH 8,0 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> Tris / salt </td><td> 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl </td><td> 1,7 </td></tr><tr><td> Elueringsbuffert </td><td> 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM imidazol </td><td> 1,8 </td></tr><tr><td> RBC Analysbuffert </td><td> 0,3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7,4 </td><td> 2,1 </td></tr><tr><td> buffert R / B </td><td> RPMI cellodlingsmedium 2 mM CaCl2 0,5% BSA </td><td&gt; 3,1 </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabell 2. Lista över buffertar som används i detta protokoll. De använda buffertar, deras sammansättning och det första steget där de används i protokollet anges. </td></tr></tbody></table>

visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy

Bakteriella toxiner binder till kolesterol i membran, bildar porer som tillåter läckage av cellulära innehåll och inflöde av material från den yttre miljön. Cellen kan antingen återhämta sig från denna förolämpning, som kräver aktiva processer membran reparation, annars dör beroende på mängden av toxin exponering och celltyp 1. Dessutom är dessa toxiner inducera starka inflammatoriska svar i infekterade värdar genom aktivering av immunceller, inkluderande makrofager, som producerar en rad av proinflammatoriska cytokiner 2. Många grampositiva bakterier producerar kolesterol bindande toxiner som har visat sig bidra till deras virulens genom i stort sett okarakteriserade mekanismer. Morfologiska förändringar i plasmamembranet hos celler som exponeras för dessa toxiner inkluderar sin sekvestrering i kolesterolrika yta utsprång, som kan utsöndras i det extracellulära utrymmet, vilket tyder på en inneboende cellulär försvarmekanismen 3,4. Denna process sker på alla celler i frånvaro av metabolisk aktivitet, och kan visualiseras med användning av EM efter kemisk fixering 4. I immunceller såsom makrofager som medierar inflammation som svar på toxin exponering induceras membranvesiklar föreslås innehålla cytokiner av IL-1-familjen och kan vara ansvarig både för att kasta toxin och sprida dessa proinflammatoriska cytokiner 5,6,7. En koppling mellan IL-1β utsläpp och en viss typ av celldöd, har kallas pyroptosis föreslagits, eftersom båda är kaspas-1 beroende processer 8. Att reda ut komplexiteten i denna makrofag svar, som inkluderar toxin bindande, utsöndring av membranvesiklar, cytokinfrisättning, och potentiellt celldöd, har vi utvecklat märkning tekniker och fluorescens metoder mikroskopi som möjliggör realtid visualisering av toxin-cell-interaktioner, inklusive mätningar av dysfunktion och död (figur 1). Användav levande cell imaging är nödvändigt på grund av begränsningar i andra tekniker. Biokemiska metoder kan inte lösa effekter som uppträder i enskilda celler, medan flödescytometri inte erbjuda hög upplösning, realtid visualisering av individuella celler. De metoder som beskrivs här kan tillämpas på kinetisk analys av svar som induceras av andra stimuli involverar komplexa fenotypiska förändringar i celler.

Typiskt 10 7 -10 8 U / ml SLO kan erhållas med en proteinkoncentration av 4 mg / ml. Den mängd av toxin som krävs för cellys varierar beroende celltyp, men är vanligen 125-500 U / ml SLO (Figur 2B). Celltyper som makrofager kan vara mer motståndskraftiga (4000 U / ml) men andra (speciellt T-cellinjer) är mer känsliga. Dessa känsligheter motsvarar kommersiellt tillgänglig SLO. Toxin aktivitet minskar ungefär 2-faldigt med varje frys-tö, så hemolytiska analyser med varje...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Metoder för rening av kolesterol bindande toxinet streptolysin O från rekombinant<em&gt; E. E. coli</em&gt; Och visualisering av toxin bindning till levande eukaryota celler beskrivs. Lokaliserad leverans av toxin inducerar snabba och komplexa förändringar i målceller avslöjar nya aspekter av toxin biologi.

Visualisering av bakterietoxin Inducerade svar Använda Live Mikroskopi Cell Fluorescens

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Visualisera cell till cell överföring av hiv med fluorescerande kloner av hiv och Live konfokalmikroskopi

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Bedöma stomatal Svar på Live bakterieceller med hela blad Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Levande cell imaging av Bacillus subtilis Och Streptococcus pneumoniae Med hjälp av automatiserade Time-lapse Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Encelliga Analys av Bacillus subtilis Biofilmer Använda fluorescensmikroskopi och flödescytometri

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Live-cell videomikroskopi av svamppatogen Fagocytos

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Visualisera protein-DNA interaktioner i levande bakteriella celler med photoactivated Single-molekyl Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation och multi fenotypisk Hög halt Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutanter

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Att mäta fysiologiska reaktioner av<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensoriska neuroner till Lipid Feromoner Använda Live Kalcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kvantifiering av Efferocytosis av Single-cell fluorescensmikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Med en bakterie patogen att sonden för cellulär och organismnivå-nivå värd Svaren

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...