Name: monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters
Uploaded: 2012-09-27T13:00:00
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Ce travail a été financé en partie par la National Science Foundation (IOS-0920417) (ACL).

1. Construction de Lentiviral Reporters luciférase Une construction reporter mammifère circadien contient généralement une cassette d&#39;expression dans lequel un promoteur circadien est fusionné avec le gène de la luciférase. Les deux stratégies de ligature et la recombinaison basée sont couramment utilisés pour le clonage d&#39;ADN. A titre d&#39;exemple, nous décrivons ici une méthode basée sur la passerelle de recombinaison pour produire un clonage P (Per2)-Luc</...

1. Modifications au Protocole actuel 1,1 appareils d&#39;enregistrement et de considérations débit En raison de sa disponibilité commerciale, la LumiCycle (Actimetrics) est devenu l&#39;appareil le plus couramment utilisé luminomètre automatisé pour enregistrement en temps réel 4,5,9,19,29-31. Le LumiCycle emploie des tubes photomultiplicateurs (PMT) en tant que détecteurs de lumière, qui offrent une extrême sensibilité et faible bruit 14,</...

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> HyClone </td><td> SH30243FS </td><td> Pour la croissance cellulaire régulier </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td> Pour luminométrie </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3091003 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep / Gln (100x) </td><td> HyClone </td><td> SV3008201 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciférine </td><td> Biosynth </td><td> L-8220 </td><td></td></tr><tr><td> La poly-L-lysine </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrène </td><td> Millipore </td><td&gt; TR-1003-G </td><td></td></tr><tr><td> La forskoline </td><td> Sigma </td><td> F6886 </td><td></td></tr><tr><td> Tous les autres produits chimiques </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Incubateur de culture tissulaire </td><td></td><td></td><td> 5% de CO2 à 37 ° C </td></tr><tr><td> Hotte de culture de tissus </td><td></td><td></td><td> BSL-2 certifié </td></tr><tr><td> Lumière fluorescente et microscope </td><td></td><td></td><td> Contraste de phase optionnelle </td></tr><tr><td> LumiCycle </td><td> Actimetrics </td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters

Chez les mammifères, de nombreux aspects du comportement et de la physiologie comme cycles veille-sommeil et le métabolisme du foie sont régis par horloges circadiennes endogènes (revu 1,2). Le rythme circadien garde-temps est un système hiérarchique multi-oscillateur réseau, avec l&#39;horloge centrale située dans le noyau suprachiasmatique (NSC) la synchronisation et la coordination des horloges extra-SCN et périphérique ailleurs 1,2. Les cellules individuelles sont des unités fonctionnelles pour la production et l&#39;entretien des rythmes circadiens 3,4, et ces oscillateurs de différents types de tissus de la part d&#39;un organisme remarquablement semblable mécanisme biochimique rétroaction négative. Toutefois, en raison des interactions au niveau du réseau neuronal dans le SCN et à travers rythmiques, les indices systémiques au niveau organismique, les rythmes circadiens au niveau organismique ne sont pas nécessairement cell-autonomous 5-7. Par rapport aux études traditionnelles de l&#39;activité locomotrice in vivo et ex vivo d&#39;explants SCN, cell-fondé des tests in vitro permettent la découverte de cellules autonomes défauts circadiens 5,8. Stratégiquement, à base de cellules modèles sont plus dociles expérimentalement pour la caractérisation phénotypique et la découverte rapide des mécanismes d&#39;horloge de base 5,8-13. Parce que les rythmes circadiens sont dynamiques, les mesures longitudinales avec une haute résolution temporelle sont nécessaires pour évaluer la fonction horloge. Ces dernières années, l&#39;enregistrement bioluminescence en temps réel en utilisant la luciférase de luciole en tant que journaliste est devenu une technique courante pour étudier les rythmes circadiens chez les mammifères 14,15, car elle permet l&#39;examen de la persistance et de la dynamique moléculaire des rythmes. Pour surveiller des cellules autonomes rythmes circadiens de l&#39;expression des gènes, les journalistes luciférase peut être introduit dans les cellules par transfection transitoire 13,16,17 ou transduction stable 5,10,18,19. Nous décrivons ici un protocole de transduction stable à l&#39;aide de gènes médié par lentivirus. Te système de vecteur lentiviral est supérieur aux méthodes traditionnelles telles que la transfection transitoire et la transmission germinale en raison de son efficacité et la polyvalence: il permet l&#39;exécution efficace et une intégration stable dans le génome de l&#39;hôte à la fois la division et non les cellules en division 20. Une fois une lignée cellulaire journaliste est établie, la dynamique de la fonction d&#39;horloge peut être examiné à travers l&#39;enregistrement de bioluminescence. Nous décrivons d&#39;abord la génération de P (Per2)-d lignes journaliste Luc, puis présentent les données de cette étude et d&#39;autres journalistes circadiens. Dans ces essais, les fibroblastes de souris 3T3 et U2OS cellules d&#39;ostéosarcome humains sont utilisés comme modèles cellulaires. Nous discutons également de multiples façons d&#39;utiliser ces modèles dans les études d&#39;horloge circadienne. Les méthodes décrites ici peuvent être appliqués à une grande variété de types de cellules pour étudier les bases cellulaires et moléculaires des horloges circadiennes, et peut s&#39;avérer utile dans la résolution des problèmes dans d&#39;autres systèmes biologiques.

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Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Horloges circadiennes fonctionner dans des cellules individuelles, c&#39;est à dire qu&#39;ils sont des cellules autonomes. Ici, nous décrivons les méthodes pour générer des modèles d&#39;horloge cellules autonomes utilisant des méthodes non-invasives, la luciférase technologie basée sur la bioluminescence en temps réel. Cellules Reporter fournir traitables, des systèmes de modèles fonctionnels pour l&#39;étude de la biologie circadienne.

Surveillance de cellules autonomes Rythmes horloge circadienne de l&#39;expression génique par Reporters Bioluminescence luciférase

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

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