Name: monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters
Uploaded: 2012-09-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av National Science Foundation (IOS-0.920.417) (ACL).

1. Konstruktion av Lentiviral Luciferas Reportrar En däggdjurspromotor cirkadiska reporterkonstruktion innehåller vanligtvis en expressionskassett i vilken en dygnsrytm promotor fuserad med luciferasgenen. Både ligerings-och rekombination-baserade strategier används ofta för DNA-kloning. Som ett exempel, beskriver vi här en rekombination-baserad metod gateway kloning för att generera P (PER2)-d Luc Lentiviral reporter, i vilken den destabiliserade luciferas (Luc</e...

1. Ändringar av nuvarande protokollet 1,1 inspelningsenheter och genomströmning överväganden På grund av dess kommersiella tillgänglighet har LumiCycle (Actimetrics) blivit den mest använda automatiserade luminometer enhet för realtidsinspelning 4,5,9,19,29-31. Den LumiCycle använder fotomultiplikatorrör (PMT) som Ijusdetektorer, som ger extremt hög känslighet och lågt brus 14, och därför är särskilt lämplig för datainsamling a...

<table border="1"><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> HyClone </td><td> SH30243FS </td><td> För regelbunden celltillväxt </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td> För luminometri </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3091003 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep / Gin (100x) </td><td> HyClone </td><td> SV3008201 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td> Biosynth </td><td> L-8220 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-lysin </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Millipore </td><td&gt; TR-1003-G </td><td></td></tr><tr><td> Forskolin </td><td> Sigma </td><td> F6886 </td><td></td></tr><tr><td> Alla andra kemikalier </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Utrustning </td></tr><tr><td> Vävnadsodlingsinkubator </td><td></td><td></td><td> 5% CO2 vid 37 ° C </td></tr><tr><td> Vävnadskultur huva </td><td></td><td></td><td> BSL-2-certifierad </td></tr><tr><td> Ljus &amp; fluorescensmikroskop </td><td></td><td></td><td> Faskontrast valfritt </td></tr><tr><td> LumiCycle </td><td> Actimetrics </td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters

Hos däggdjur är många aspekter av beteende och fysiologi, såsom sömn-vakna cykler och levermetabolism regleras av endogena dygnsklockan (omdömet 1,2). Den dygnsrytm tidhållning systemet är en hierarkisk flera oscillator nätverk med den centrala klockan belägen i suprachiasmatiska kärnan (SCN) synkronisera och samordna extra SCN och perifera klockor håll 1,2. Individuella celler är de funktionella enheterna för produktion och underhåll av dygnsrytmer 3,4, och dessa oscillatorer med olika vävnadstyper i organismen delar en anmärkningsvärt liknande biokemisk negativ återkopplingsmekanism. Men på grund av interaktioner på neuronala nätverket nivå i SCN och genom rytmiska, systemiska signaler på organismbiologi nivå, dygnsrytmen på organismbiologi nivå inte nödvändigtvis cell-autonoma 5-7. Jämfört med traditionella studier av rörelseaktivitet in vivo och explantat SCN ex vivo, c.ell-baserade in vitro-analyser tillåter upptäckt av cell-autonoma dygnsrytm defekter 5,8. Strategiskt cellbaserade modeller är mer experimentellt lätthanterliga för fenotypisk karaktärisering och snabb upptäckt av grundläggande klocka mekanismer 5,8-13. Eftersom dygnsrytmen är dynamiska, är längsgående mätningar med hög tidsupplösning för att bedöma klockfunktion. Under de senaste åren har i realtid bioluminiscens inspelning med eldflugeluciferas som reporter blivit en vanlig metod för att studera dygnsrytmen hos däggdjur 14,15, eftersom den möjliggör undersökning av persistens och dynamiken av molekylära rytmer. För att övervaka cell-autonoma dygnsrytm av genuttryck kan luciferas reportrar införas i celler via transient transfektion 13,16,17 eller stabil transduktion 5,10,18,19. Här beskriver vi en stabil transduktion protokoll med lentivirus-medierad gen leverans. Than lentivirusvektor systemet är överlägset traditionella metoder såsom övergående transfektion och könsceller överföring på grund av dess effektivitet och mångsidighet: den medger effektiv leverans och stabil integration i värdgenomet både delande och icke-delande celler 20. När en reporter cellinje etableras, kan dynamiken i klockfunktionen examineras genom bioluminiscens inspelning. Vi beskriver först generationen P (PER2)-d Luc reporter linjer och sedan presentera data från denna och andra dygnsrytm reportrar. I dessa analyser, är 3T3 musfibroblaster och U2OS humana osteosarkomceller som cellulära modeller. Vi diskuterar också olika sätt att använda dessa klocka modeller dygnsrytm studier. Metoder som beskrivs här kan appliceras på en stor variation av celltyper att studera cellulära och molekylära grunden för dygnsklockan och kan vara användbar för att hantera problem i andra biologiska system.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters at JoVE.com

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Dygnsklockan fungera inom enskilda celler, dvs de är cell-autonoma. Här beskriver vi metoder för att generera cell-autonoma klocka modeller med icke-invasiv, luciferas-baserad realtid bioluminiscens teknik. Reporter celler ger foglig, funktionella modellsystem för att studera dygnsrytm biologi.

Övervakning Cell-autonoma dygnsrytm klocka rytmer av genuttryck Använda Luciferas bioluminiscens Reportrar

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriell Gene Expression Analysis Använda Microarrays

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analys av global RNA syntes vid den inre cellnivå efter Hypoxi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Mätning av ämnesomsättning i<em&gt; Drosophila</em&gt; Med respiration

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Övervakning endoplasmanätet kalciumhomeostas med hjälp av en<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferas SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Detektion av intracellulära genuttryck i levande celler av Murine, Mänsklig och svin användning av fluorescens-märkta Nanopartiklar

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

Snabb analys av dygns Fenotyper i Arabidopsis protoplaster transfekterade med en lysande klocka Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...