Name: measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes
Uploaded: 2013-03-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2) של Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), המשרד הפדרלי לכלכלה וטכנולוגית פרויקט לצים-KF 2727801MD0 והמרכז לכשירות חדשנות - תגובות חיסוניות הומורלית במחל לב וכלי דם ( זיק בטרמפים, BMBF FKZ 03Z2CN12) של המשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר, גרמניה. שיכון וניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להמלצות של החברה למעבדה בבעלי חי מדע (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) והפדרציה של מעבדה אירופית למדע בעלי חיים אגודים (FELASA).

1. בידוד נוגדנים מדגימות מטופל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עמודות המיני immunoadsorption ידי מילוי 3 מ&quot;ל אנטי IgG sepharose לכל 2 מיליליטר מטופל EDTA פלזמה לעמודה ריקה Econo פאק. IgG בידוד דורש לפחות 2 מ&quot;ל של פלזמת חולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח על גבי מס?...

<ol>
	<li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (4), e18 (2011).</li><li>Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-heart+autoantibodies+in+familial+dilated+cardiomyopathy.">Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy.</a> Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+mechanisms+underlying+dilated+cardiomyopathy.">Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy.</a> Circ. J. 73 (4), 602 (2009).</li><li>Felix, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+effects+of+immunoadsorption+and+subsequent+immunoglobulin+substitution+in+dilated+cardiomyopathy:+Three-month+results+from+a+randomized+study.">Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).</li><li>Staudt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+immunoglobulin+G3+subclass+in+dilated+cardiomyopathy:+results+from+protein+A+immunoadsorption.">Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption.</a> Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).</li><li>Nikolaev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fluorescence+method+for+the+rapid+detection+of+functional+beta1-adrenergic+receptor+autoantibodies+in+heart+failure.">A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).</li><li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+activating+human+beta1-adrenergic+receptors+are+associated+with+reduced+cardiac+function+in+chronic+heart+failure.">Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure.</a> Circulation. 99 (5), 649 (1999).</li><li>Gocayne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+of+rat+cardiac+beta-adrenergic+and+muscarinic+cholinergic+receptors+obtained+by+automated+DNA+sequence+analysis:+further+evidence+for+a+multigene+family.">Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).</li><li>Jaenicke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+sequence+of+the+human+beta-myosin+heavy+chain+gene+and+a+comparative+analysis+of+its+product.">The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product.</a> Genomics. 8 (2), 194 (1990).</li><li>Piper, H. M., Volz, A., Schwartz, P., Piper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , (1990).</li><li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+endothelial+cells+remodel+cultured+adult+cardiomyocytes+and+increase+their+survival.">Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival.</a> Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).</li><li>Magnusson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.+Characterization+of+antibodies+against+the+beta+1-adrenoceptor+with+positive+chronotropic+effect.">Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect.</a> Circulation. 89 (6), 2760 (1994).</li><li>Wakefield, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+in+vitro+methods+to+safety+pharmacology.">The application of in vitro methods to safety pharmacology.</a> Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).</li><li>Kajzar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+physiological+conditions+for+cell+analyses:+forces+of+heart+muscle+cells+suspended+between+elastic+micropillars.">Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars.</a> Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).</li></ol>

השיטה הוצגה מציעה דרך מתאימה כדי לזהות נוגדנים עצמיים לבביים יעילים תפקודיים בחולים עם DCM ממוצא לא ברור. בהשוואה לשיטות אחרות, למשל זיהוי של נוגדנים פעילים נגד פונקציונליים β1-adrenoceptor לפי חשיבותם ברמות cAMP 6, השיטה שלנו אינה תלויה בepitope ספציפי. כמובן שיש מבחני...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב / הציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> פתרון Immunosorba שימור </td><td> Fresenius טיפול רפואי </td><td> 903609211 </td><td></td></tr><tr><td> סוג collagenase 2 </td><td> מערכת תא </td><td> LS004176 </td><td></td></tr><tr><td> BSA, חומצות שומן חופשי </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A6003 </td><td></td></tr><tr><td> Laminin </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-02:00 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> F0888 </td><td> 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בDMSO </td></tr><tr><td> עמודות Econo פאק כרומטוגרפיה </td><td> BioRad </td><td> 732-1010 </td><td></td></tr><tr><td> ספקטרה / פור יוטק התאי אסתר דיאליזת Membranדואר </td><td> Spectrumlabs </td><td> 131417 </td><td></td></tr><tr><td> 4 גם הקבורים Coverglass </td><td> Nunc </td><td> 155383 </td><td></td></tr><tr><td> סיד Myocyte ומערכת הקלטת contractility </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> תוכנת ניתוח IonWizard 6.0 </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes

קרדיומיופתיה המורחבת (DCM) היא האחד הגורמים העיקריים לאי ספיקת לב במבוגרים הצעירים 1. למרות נטייה גנטית וחשיפה לחומרים רעילים ידועות סיבות למחלה זו כבשליש מהחולים, מקורו של DCM נותר במידה רבה בלתי ברור. במספר לא מבוטל של חולים אלה, נוגדנים העצמיים נגד אפיטופים לב שכבר זוהה וחשודים לשחק תפקיד מרכזי בתחילת ההתקדמות של המחלה 2,3. החשיבות של נוגדנים עצמיים לב מודגשת על ידי שיפור המודינאמית נצפה בחולי DCM נטרול נוגדנים עצמיים על ידי immunoadsorption 3-5. מגוון רחב של אנטיגנים ספציפיים כבר זוהה 2,3 ונוגדנים נגד יעדים אלה עשויים להיות מזוהים על ידי immunoassays. עם זאת, המבחנים הללו אינם יכולים להבחין בין הגירוי (ולכן פונקציונליים יעיל) וחסימת נוגדנים עצמיים. יש גובר evidence כי הבחנה זו היא חיוני 6,7. כמו כן, ניתן להניח כי היעדים למספר נוגדני cardiotropic עדיין לא מזוהים ולכן אינו ניתן לגילוי על ידי immunoassays. לכן, הקים שיטה לגילוי נוגדנים תפקודיים פעילים cardiotropic, עצמאיים של אנטיגן החוקי. הרקע לשיטה הוא ההומולוגיה הגבוהה בדרך כלל נצפתה לאזורים פעילים של חלבונים בלב בין יונקים 8,9. הדבר מצביע על כך נוגדני לב הופנו נגד אנטיגנים אנושיים יחצו-מגיבים עם תאי המטרה שאינם בני אדם, המאפשרים בדיקה של נוגדנים מחולי DCM על cardiomyocytes חולדות בוגרות. השיטה שלנו כוללת 3 שלבים: הראשון, IgG מבודד מפלזמת מטופל באמצעות נוגדני sepharose מצמידים אנטי IgG מתקבלים מעמודות immunoadsorption (PlasmaSelect, Teterow, גרמניה). cardiomyocytes שנית, למבוגרים מבודדים על ידי זלוף collagenase במנגנון זלוף Langendorff באמצעות aprotocol שונה מעבודות הקודמות של 10,11. את cardiomyocytes מתקבל מצורפים לcoverglasses הקבורים laminin המצופה ומוכתם בFura-2, צבע פלואורסצנטי סידן סלקטיבית אשר יכולה להיות מובא בקלות לתוך התא כדי לבחון הסידן תוך תאי (Ca 2 +) תוכן 12. בשלב האחרון, ההשפעה של מטופל על IgG קיצור התא וCa 2 + ארעי של cardiomyocytes שדה מגורה מנוטר באופן מקוון באמצעות מערכת ניטור התכווצות (IonOptix, מילטון, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב) סיד myocyte מסחרי ומחובר לניאון הפוך סטנדרטי מיקרוסקופ.

שתי דוגמאות למדידת inotropy הסלולרי בתחום מגורה cardiomyocytes הבוגר (איור 2) באמצעות myocyte Ca + ומערכת הקלטת contractility 2 הם כדלקמן. איור 3 נותן רושם של מדידת שליטה, ואילו באיור 4 ההשפעה של נוגדני cardiodepressive של חולה עם DCM מוצג. <p class="jove_content" style=";text-al...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes at JoVE.com

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

השיטה הוצגה מציעה דרך לזהות נוגדנים עצמיים cardiotropic יעילים פונקציונליים בפלזמה של חולים עם קרדיומיופתיה המורחבת, ללא קשר לאנטיגן הספציפי, על ידי ניתוח ההשפעה של אימונוגלובולין חולה המבודד בקיצור הסלולר וארעי סידן תאי בcardiomyocytes חולדה המבודדת.

מדידה של אפקטי נוגדנים על תפקוד תאי של cardiomyocytes המבודד

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

מדידה של Cytosolic Ca 2 + ב lymphatics כויץ מבודד

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

בדיקת עמידות הגלוקוז בקרום הבטן, מדידה של תפקודי ריאה של קיבעון של הריאה לחקור את ההשפעה של השמנת יתר, חילוף חומרים לקוי על תוצאות ריאתי

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

הערכה של נוגדן מבוססי תרופות השפעות על מח העצם מאתר והפעלה מקרופאג הצפק

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

שיטת המדידה של תפקוד בלוטת הרוק בעכברים

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

בניית Phage סינתטי מוצגת ספריית Fab עם גיוון המותאמים

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

ההשפעה של נוגדן Anti-c-fms על היווצרות אוסטאוקלסט והתפשטות של קודמן אוסטאוקלסט במבחנה

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...