Name: measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes
Uploaded: 2013-03-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal Transregio Sonderforschungsbereich 19 (SFB/TR19, C2) della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), il Ministero Federale dell&#39;Economia e della Tecnologia progetto ZIM-KF 2727801MD0 e il Centro di Competenza Innovation - risposte immunitarie umorali in Malattie Cardiovascolari ( ZIK-ESCURSIONE, BMBF FKZ 03Z2CN12) del Ministero federale dell&#39;Istruzione e della Ricerca, in Germania. Corpo e gli esperimenti con gli animali sono stati eseguiti in conformità con le raccomandazioni della Società per Laboratorio Scienze Animali (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) e la Federazione di Laboratorio europeo di Animal Science Association (FELASA).

1. Isolamento IgG da campioni di pazienti <ol><li> Preparare mini-immunoassorbimento colonne di riempimento 3 ml di anti-IgG sepharose paziente per 2 ml di plasma EDTA in una colonna vuota Econo Pac. IgG isolamento richiede almeno 2 ml di plasma del paziente. </li><li> Collocare un filtro sopra l&#39;anti-IgG Sepharose, tagliare aprire l&#39;estremità inferiore della colonna e premere il filtro per raggiungere una portata di circa 1 goccia / sec. Lasciare la soluzione di conservazione corto di colonna. </li><li> Lava...

<ol>
	<li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (4), e18 (2011).</li><li>Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-heart+autoantibodies+in+familial+dilated+cardiomyopathy.">Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy.</a> Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+mechanisms+underlying+dilated+cardiomyopathy.">Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy.</a> Circ. J. 73 (4), 602 (2009).</li><li>Felix, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+effects+of+immunoadsorption+and+subsequent+immunoglobulin+substitution+in+dilated+cardiomyopathy:+Three-month+results+from+a+randomized+study.">Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).</li><li>Staudt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+immunoglobulin+G3+subclass+in+dilated+cardiomyopathy:+results+from+protein+A+immunoadsorption.">Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption.</a> Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).</li><li>Nikolaev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fluorescence+method+for+the+rapid+detection+of+functional+beta1-adrenergic+receptor+autoantibodies+in+heart+failure.">A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).</li><li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+activating+human+beta1-adrenergic+receptors+are+associated+with+reduced+cardiac+function+in+chronic+heart+failure.">Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure.</a> Circulation. 99 (5), 649 (1999).</li><li>Gocayne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+of+rat+cardiac+beta-adrenergic+and+muscarinic+cholinergic+receptors+obtained+by+automated+DNA+sequence+analysis:+further+evidence+for+a+multigene+family.">Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).</li><li>Jaenicke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+sequence+of+the+human+beta-myosin+heavy+chain+gene+and+a+comparative+analysis+of+its+product.">The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product.</a> Genomics. 8 (2), 194 (1990).</li><li>Piper, H. M., Volz, A., Schwartz, P., Piper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , (1990).</li><li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+endothelial+cells+remodel+cultured+adult+cardiomyocytes+and+increase+their+survival.">Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival.</a> Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).</li><li>Magnusson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.+Characterization+of+antibodies+against+the+beta+1-adrenoceptor+with+positive+chronotropic+effect.">Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect.</a> Circulation. 89 (6), 2760 (1994).</li><li>Wakefield, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+in+vitro+methods+to+safety+pharmacology.">The application of in vitro methods to safety pharmacology.</a> Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).</li><li>Kajzar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+physiological+conditions+for+cell+analyses:+forces+of+heart+muscle+cells+suspended+between+elastic+micropillars.">Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars.</a> Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).</li></ol>

Il metodo proposto offre un modo adatto a rilevare autoanticorpi funzionalmente efficaci cardiaci in pazienti con DCM di origine poco chiara. In confronto ad altri metodi, ad esempio il rilevamento di anticorpi funzionali attivi contro l&#39;β1-adrenocettori da loro impatto sui livelli di cAMP 6, il nostro metodo è indipendente da uno specifico epitopo. Naturalmente ci sono altri saggi indipendenti epitopi descritti nella letteratura, cioè contando il tasso battendo cardiomiociti neonatal...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Immunosorba conservazione soluzione </td><td> Fresenius Medical Care </td><td> 903609211 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi di tipo 2 </td><td> Cella di sistema </td><td> LS004176 </td><td></td></tr><tr><td> BSA, acidi grassi liberi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6003 </td><td></td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0888 </td><td> 1 mg / ml in DMSO </td></tr><tr><td> Econo Pac Cromatografia Colonne </td><td> BioRad </td><td> 732-1010 </td><td></td></tr><tr><td> Spectra / Por Biotech Cellulosa Ester dialisi Membrane </td><td> Spectrumlabs </td><td> 131417 </td><td></td></tr><tr><td> 4 ben Chambered vetrino </td><td> Nunc </td><td> 155383 </td><td></td></tr><tr><td> Calcio miociti e Sistema di registrazione contrattilità </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IonWizard 6,0 ​​software di analisi </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes

Cardiomiopatia dilatativa (DCM) è una delle principali cause di insufficienza cardiaca nei giovani adulti 1. Sebbene predisposizione genetica ed esposizione a sostanze tossiche sono note cause per questa malattia in circa un terzo dei pazienti, l&#39;origine di DCM rimane poco chiara. In un numero considerevole di questi pazienti, gli anticorpi contro epitopi cardiaci sono stati individuati e sono sospettati di svolgere un ruolo centrale nella insorgenza e la progressione della malattia 2,3. L&#39;importanza di autoanticorpi cardiache è sottolineata da un miglioramento emodinamico osservato nei pazienti DCM dopo l&#39;eliminazione di autoanticorpi da immunoassorbimento 3-5. Una varietà di antigeni specifici sono già stati individuati 2,3 e anticorpi contro tali obiettivi possono essere rilevati da immunosaggi. Tuttavia, questi test non può discriminare tra stimolante (e quindi funzionalmente efficaci) e bloccando autoanticorpi. Vi è una crescente evidence che questa distinzione è cruciale 6,7. Si può anche ritenere che gli obiettivi di un certo numero di anticorpi cardiotropic sono ancora da identificare e pertanto non può essere rilevato dal test immunologici. Pertanto, abbiamo stabilito un metodo per la rilevazione di anticorpi funzionalmente attivi cardiotropic, indipendentemente dal loro rispettivo antigene. Lo sfondo per il metodo è l&#39;alta omologia di solito osservata per le regioni funzionali di proteine ​​cardiache nei mammiferi tra 8,9. Questo suggerisce che gli anticorpi diretti contro antigeni cardiaci umani reazione crociata con non umani cellule bersaglio, che permette prove di IgG da pazienti DCM su cardiomiociti di ratto adulto. Il nostro metodo si compone di 3 fasi: la prima, IgG è isolato dal plasma del paziente con sefarosio accoppiati anti-IgG anticorpi ottenuti da colonne immunoassorbimento (PlasmaSelect, Teterow, Germania). Secondo, cardiomiociti adulti sono isolati mediante perfusione con collagenasi in un apparato perfusione Langendorff utilizzando apROTOCOLLO modificato da lavori precedenti 10,11. I cardiomiociti ottenuti sono allegati alla laminina rivestite chambered vetrini colorati con Fura-2, un inibitore selettivo colorante fluorescente che può essere facilmente portato nella cella di osservare intracellulare di calcio (Ca 2 +) contenuti 12. Nell&#39;ultimo passaggio, l&#39;effetto del paziente IgG sulla riduzione delle cellule e Ca 2 + transitori di cardiomiociti campo stimolate è monitorato on-line utilizzando un calcio commerciale miociti e sistema di monitoraggio contrattilità (IonOptix, Milton, MA, USA) collegato ad una fluorescente standard di inversa microscopio.

Due esempi per la misurazione di inotropismo cellulare nel campo stimolato cardiomiociti adulti (figura 2) utilizzando una miociti Ca 2 + e registrazione contrattilità sono riportati di seguito. Figura 3 dà l&#39;impressione di una misura di controllo, mentre in figura 4 l&#39;effetto di anticorpi cardiodepressive di un paziente con DCM è mostrato. In entrambi gli esempi, accorciamento cellula iniziale e Ca 2 + trans...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes at JoVE.com

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Il metodo proposto offre un modo per rilevare funzionali autoanticorpi cardiotropic efficaci nel plasma di pazienti con cardiomiopatia dilatativa, indipendentemente l&#39;antigene specifico, analizzando l&#39;impatto di immunoglobulina paziente isolato su accorciamento cellulare e transienti di calcio intracellulare in cardiomiociti isolati di ratto.

Misurazione degli effetti degli anticorpi sulla funzione cellulare di cardiomiociti isolati

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Misura della Ca citosolico 2 + In isolati Linfatici contrattile

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su RBL-2H3 Mast cellule Degranulazione: Effetti del Triclosan senza l&#39;uso di un solvente organico

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Metodi per quantitativa individuazione di anticorpi indotta da attivazione del complemento sui globuli rossi

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flusso analisi di citometria di Particle-bound Bet v 1 allergene in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Identificazione di un Epitopo Lineare B-cell monoclonale riconosciuto Peptide scansione-assistito

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Prova di tolleranza di glucosio intraperitoneale, misura della funzione polmonare e la fissazione del polmone per studiare l'impatto dell'obesità e metabolismo alterato sugli esiti polmonare

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Valutazione degli effetti di farmaci a base di anticorpi sul midollo osseo murino e l'attivazione dei macrofagi peritoneali

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Un metodo per la misurazione della funzione della ghiandola salivaria in topi

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

Costruzione del fago sintetico visualizzato favolosa biblioteca con diversità su misura

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Effetto dell'anticorpo Anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti e la proliferazione dei precursori degli osteoclasti In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...