Name: studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations
Uploaded: 2012-09-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations at JoVE.com

We zijn dankbaar voor S. Taylor voor het verstrekken van de pLPCX-histon H2-GFP plasmide. Wij danken R. Mertelsmann voor continue ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft.

1. Zaaien van U2OS gebaseerde Cycline B-SNAP Reporter cellen (kloon 11 Cellen 6) op Microscoop Chamber Slides <ol><li> Trypsinize subconfluente SNAP reporter cellen mochten groeien asynchroon in logfase ten minste 48 uur. </li><li> Werken met 8 goed microscoop kamers (constante verdeling van cellen). </li></ol> Voor het zaaien van cellen op 8 goed microscoop kamers met een constante verdeling over het gehele oppervlak van de microscoop kamer centrifuge 10.000 cellen en resuspendeer i...

<ol>
	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

We presenteren hier een live-cell imaging benadering het vergemakkelijken van de gelijktijdige bewaking van cycline B proteolyse en chromosoom uitlijning. Deze aanpak maakt het mogelijk de studie van de mitotische controle in celpopulaties onverstoorbaar op de enkele cel niveau. Cycline B afbraakcurven vergemakkelijken direct inzicht in de activiteit van de APC / C en daarmee indirect geven de status van de SAC 6. Deze benadering, hoewel vastgesteld op basis van de Scan ^ R softwa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het product </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Reporter cellijn </td><td> gegenereerd in-house zoals beschreven 6 </td><td> klonen 11 verslaggever cellen (U2Os gebaseerde cycline B-SNAP expressie brengende cellen) </td><td></td></tr><tr><td> Retrovirale cycline B-SNAP expressievector </td><td> gegenereerd in-house zoals beschreven 6 </td><td> pLNCX2-cycline B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Fenolrood-vrij DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> Suppletie met FCS, natriumpyruvaat, penicilline / strepto-mycin vereist </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Star </td><td> New England Biolabs </td><td> S9105S </td><td> Voorraadoplossing in DMSO 400 uM </td></tr><tr><td> Speciale Opstics Plate, 96 en </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Slide 8 goed, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopie eenheid </td><td> Olympus </td><td> IX-81 inverse microscoop met klimaatkamer </td><td></td></tr><tr><td> Objectief </td><td> Olympus </td><td> UPLSAPO 20x objectief (NA 0,75) </td><td></td></tr><tr><td> Acquisitie software </td><td> Olympus </td><td> Scan ^ R Acquisition software (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> Analysis software </td><td> Olympus </td><td> Scan ^ R Analyse software (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

Gelijke verdeling van de chromosomen tussen de twee dochtercellen tijdens de celdeling is een voorwaarde voor het waarborgen van de genetische stabiliteit 1. Onjuistheden in de loop van chromosoom scheiding zijn een kenmerk van maligniteit en geassocieerd met progressieve ziekte 2-4. De assemblage van de spoel checkpoint (SAC) is een mitotische surveillance mechanisme dat tegenhoudt cellen in metafase tot elk chromosoom heeft een stabiele bipolaire gehechtheid aan de mitotische spindel 1. De SAC oefent zijn functie door interferentie met de activerende APC / C subunit Cdc20 voor proteolyse van securin en cycline B en dus chromosoom scheiding en mitotische uitgang blokkeren. Onjuiste bevestiging van chromosomen voorkomt silencing van SAC signalering en veroorzaakt voortgezet remming van APC / C Cdc20 totdat het probleem is opgelost op chromosoom missegregation, aneuploïdie en kwaadaardige gezwellen te voorkomen 1. De meeste studies die de i aangepaktnfluence van onjuiste chromosomale beslag op APC / C-afhankelijke proteolyse maakte gebruik van as verstoring met depolymeriseren of microtubuli-stabiliserende medicijnen te bemoeien met chromosomale gehechtheid aan microtubuli. Omdat interferentie met microtubule kinetiek kan het transport en lokalisatie van kritische regulators beïnvloeden deze procedures voorzien van een risico op het induceren kunstmatige effecten 5. Om te onderzoeken hoe de SAC interfereert met APC / C-afhankelijke proteolyse van cycline B tijdens de mitose in onverstoorbaar celpopulaties, hebben we een histon H2-GFP-gebaseerd systeem waardoor de gelijktijdige monitoring van metafase afstemming van mitotische chromosomen en proteolyse van cycline B 6 . Proteolytische profielen tonen, maakten wij een chimeer cycline B reporter molecuul met een C-terminale deel SNAP 6 (figuur 1). In een zelf-labelingsreactie, de SNAP-groep kan covalente bindingen vormen metalkylguanine-dragers (SNAP substraat) 7,8 (figuur 1). SNAP substraatmoleculen zijn gemakkelijk verkrijgbaar en hebben een breed spectrum van verschillende fluorochromen. Chimere cycline B-SNAP moleculen worden gelabeld na toevoeging van het membraan doorlatend substraat SNAP het kweekmedium 7 (figuur 1). Na de labelingsreactie, de cycline B-SNAP fluorescentie-intensiteit druppels in een pulse-chase reactie-achtige wijze en fluorescentie-intensiteiten tijdens niveaus van cycline B afbraak 6 (figuur 1). Ons systeem vergemakkelijkt de controle op mitotische APC / C-afhankelijke Proteolyse in grote aantallen cellen (of meerdere celpopulaties) in parallel. Daardoor kan het systeem een ​​waardevol instrument om agenten / kleine moleculen die in staat zijn met proteolytische activiteit interfereren bij de metafase anafase om de overgang te identificeren. Bovendien is de synthese van cycline B tijdens mitose Onlangs werd een belangrijk mechanistischm in het bevorderen van een mitotische blok in muizen en mensen door het houden van cycline B expressie niveaus stabiel 9,10, dit systeem ons in staat om cycline B proteolyse te analyseren als een element van een evenwichtige balans 6.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations at JoVE.com

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Metafase naar anafase transitie wordt geactiveerd door middel van anafase-bevorderende complex (APC / C)-afhankelijke ubiquitinering en de daarop volgende vernietiging van cycline B. Hier hebben we een systeem dat, na pulse-chase etikettering, maakt het monitoren cycline B proteolyse in hele cel populaties en vergemakkelijkt de detectie van inmenging van de mitotische checkpoint.

Het bestuderen van Proteolyse van cycline B op de enkele cel niveau in Hele celpopulaties

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Research

JoVE Journal

Biology

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

Whole-cell Opnames van Licht prikkelende synaptische Stromingen opgeroepen in het netvlies Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Het verkrijgen van hoge kwaliteit-RNA van Single celpopulaties in Human postmortaal hersenweefsel

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Methode voor het meten van virale Fusion Kinetics bij de Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Single-cell Suction Recordings van Mouse Cone fotoreceptoren

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Kwantitatieve meting van Invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in Single en Meercellige contexten

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Generatie Dispersed presomitische Mesoderm Cell Cultures for Imaging van de zebravis Segmentatie Klok in enkele cellen

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse van Global RNA synthese in de Single Cell Level volgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Analyse van de LINE-1 retrotransposition bij de Single Nucleus niveau

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

CUBIC Protocol Visualiseert Protein Expression op enkel cel resolutie in Whole Mount Skin Voorbereidingen

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...