Name: studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations
Uploaded: 2012-09-17T13:00:00
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Wir sind dankbar, S. Taylor für die Bereitstellung der pLPCX-Histone H2-GFP-Plasmid. Wir danken R. Mertelsmann für die kontinuierliche Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft unterstützt.

Ein. Seeding der U2OS-basierte Cyclin B-SNAP Reporter Cells (Clone 11 Cells 6) auf Mikroskop Chamber Slides <ol><li> Trypsinieren subkonfluenten SNAP Reporter Zellen, die erlaubt, asynchron wachsen in log-Phase für mindestens 48 h wurden. </li><li> Arbeiten mit 8 gut Mikroskop Kammern (konstante Verteilung der Zellen). </li></ol> Zum Beimpfen von Zellen auf 8-Well-Mikroskop-Kammern mit einer konstanten Verteilung über die gesamte Fläche des Mikroskops Kammer Zentrifuge 10.000 Zell...

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	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

Wir stellen Ihnen hier eine Live-Cell-Imaging-basierten Ansatz erleichtert die gleichzeitige Überwachung von Cyclin B Proteolyse und Chromosom Ausrichtung. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der mitotischen Kontrolle in ungestörten Zellpopulationen an der einzelnen Zelle. Cyclin B Abbaukurven erleichtern direkten Einblick in die Aktivität des APC / C und damit indirekt geben den Status des SAC 6. Dieser Ansatz, obwohl gegründet basierend auf dem Scan ^ R-Software, kann...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Produkts </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Reporter-Zelllinie </td><td> generiert in-house wie beschrieben 6 </td><td> Klon 11 Reporterzellen (U2OS basierenden Cyclin B-SNAP exprimierende Zellen) </td><td></td></tr><tr><td> Retrovirale Cyclin B-SNAP Expressionsvektor </td><td> generiert in-house wie beschrieben 6 </td><td> pLNCX2-Cyclin B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolrot-freiem DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> Supplementierung mit FCS, Natriumpyruvat, Penicillin / Streptomycin-mycin erforderlich </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Star </td><td> New England Biolabs </td><td> S9105S </td><td> Stammlösung 400 uM in DMSO </td></tr><tr><td> Besondere Opstics Plate, 96 well </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Slide 8 gut, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskopie-Einheit </td><td> Olymp </td><td> IX-81 inverse Mikroskop mit Klimakammer </td><td></td></tr><tr><td> Ziel </td><td> Olymp </td><td> UPLSAPO 20x-Objektiv (NA 0,75) </td><td></td></tr><tr><td> Acquisition Software </td><td> Olymp </td><td> Scan ^ R Acquisition Software (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> Analyse-Software </td><td> Olymp </td><td> Scan ^ R Analysis Software (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

Gleichmäßige Verteilung der Chromosomen auf die beiden Tochterzellen bei der Zellteilung ist eine Voraussetzung für die Gewährleistung der genetischen Stabilität 1. Ungenauigkeiten bei der Trennung der Chromosomen sind ein Markenzeichen der Bösartigkeit und mit fortschreitender Erkrankung 2-4. Die Spindelanordnung Prüfpunkt (SAC) eine mitotische Überwachungsmechanismus zurückhält, die Zellen in der Metaphase bis jeder einzelnen Chromosom eine stabile Befestigung an der bipolaren mitotischen Spindel 1 hergestellt wurde. Der SAC übt seine Funktion durch Interferenz mit der aktivierenden APC / C-Untereinheit Cdc20 Proteolyse des Securin und Cyclin B und damit Trennung der Chromosomen und mitotische Ausfahrt blockieren. Bei unsachgemäßer Befestigung von Chromosomen verhindert Silencing SAC-Signalisierung und führt fort Hemmung der APC / C Cdc20, bis das Problem behoben ist auf Chromosom missegregation, Aneuploidie und bösartigen Neubildungen 1 zu vermeiden. Die meisten Studien, die die i adressiertnfluence unsachgemäßer chromosomale Befestigung an APC / C-abhängige Proteolyse nutzte der Spindel Störungen mit Depolymerisation oder Mikrotubuli-stabilisierende Medikamente mit chromosomalen Bindung an Mikrotubuli stören. Da Störungen Mikrotubuli Kinetik des Transports und Lokalisierung der kritischen Regulatoren beeinflussen können, tragen diese Verfahren ein Risiko der Induktion künstliche Effekte 5. Um zu untersuchen, wie die SAC mit APC / C-abhängige Proteolyse von Cyclin B stört während der Mitose in ungestörten Zellpopulationen, haben wir ein Histon H2-GFP-basiertes System, das erlaubt die gleichzeitige Überwachung von Metaphase Ausrichtung der mitotischen Chromosomen und Proteolyse von Cyclin B 6 . Einen proteolytischen Profile darstellen, erzeugten wir eine chimäre Cyclin B Reportermolekül mit einem C-terminalen SNAP-Einheit 6 (Abbildung 1). In einem Self-Labelling Reaktion ist der SNAP-Einheit in der Lage, kovalente Bindungen mit bildenAlkylguanin-Trägern (SNAP Substrat) 7,8 (Abbildung 1). SNAP Substratmolekülen sind leicht verfügbar und führen ein breites Spektrum verschiedener Fluorochrome. Chimäres Cyclin B-SNAP-Moleküle geworden markierten bei Zugabe des Membran-permeablen Substrat SNAP zum Wachstumsmedium 7 (Abbildung 1). Nach der Markierungsreaktion sinkt die Cyclin B-SNAP Fluoreszenzintensität in einem Puls-Chase-Reaktion-artig und Fluoreszenzintensitäten reflektieren Ebenen von Cyclin B Abbau 6 (Abbildung 1). Unserem System erleichtert die Überwachung der mitotischen APC / C-abhängige Proteolyse in einer großen Anzahl von Zellen (oder mehrere Zellpopulationen) parallel. Dabei kann das System ein wertvolles Werkzeug, um Agenten / kleine Moleküle, die in der Lage, mit proteolytischer Aktivität in der Metaphase stören den Übergang Anaphase zu identifizieren sein. Darüber hinaus hat die Synthese von Cyclin B während der Mitose kurzem als wichtiges mechanis vorgeschlagen wordenm bei der Förderung eines mitotischen Block in Mäusen und Menschen, indem sie Cyclin B Expression stabiler 9,10, aktiviert dieses System uns Cyclin B Proteolyse als ein Element eines ausgewogenen Gleichgewichts 6 analysieren.

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Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Metaphase zur Anaphase Übergang durch Anaphase-promoting complex (APC / C)-abhängige Ubiquitinierung und anschließende Zerstörung von Cyclin B. Hier haben wir ein System, das Pulse-Chase-Kennzeichnung nach, ermöglicht die Überwachung Cyclin B Proteolyse im gesamten Zellpopulationen und wird ausgelöst, erleichtert den Nachweis von Störungen durch den mitotischen Checkpoint.

Studieren Proteolyse von Cyclin B an der Single Cell Level in Whole Cell Populationen

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Research

JoVE Journal

Biology

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