Name: studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations
Uploaded: 2012-09-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations at JoVE.com

אנו מודים לס טיילור למתן H2-GFP פלסמיד pLPCX-היסטון. אנו מודים לר &#39;Mertelsmann לתמיכה מתמשכת. עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה.

1. זריעה של תאי U2OS מבוססי cyclin B-SNAP Reporter (11 תאים משובטים 6) בשקופיות קאמריות מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאי כתב SNAP subconfluent שהורשו לגדול באופן אסינכרוני בשלב יומן במשך לפחות 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה עם 8 תאי מיקרו?...

<ol>
	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

אנו מציגים כאן גישה מבוססת הדמיה חייה תאים להקל ניטור סימולטני של proteolysis cyclin B ויישור כרומוזום. גישה זו מאפשרת לימוד שליטה בהמיטוטי מוטרדת אוכלוסיות תאים ברמת התא הבודדה. עקומות שפלת B cyclin להקל תובנה ישירות לפעילות של APC / C ובכך בעקיפין משקפות את המצב של 6 SAC. <p cla...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של מוצר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> שורת תאי כתב </td><td> נוצר בבית כמתואר 6 </td><td> שיבוט תאי כתב 11 (תאי cyclin U2Os מבוססי B-SNAP מבטאים) </td><td></td></tr><tr><td> וקטור cyclin retroviral B-SNAP ביטוי </td><td> נוצר בבית כמתואר 6 </td><td> pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolred ללא DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> תוספת של FCS, פירובט נתרן, פניצילין / strepto-mycin נדרשת </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Star </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> S9105S </td><td> 400 מיקרומטר פתרון לניירות הערך בDMSO </td></tr><tr><td> פלייט Opstics מיוחד, 96 גם </td><td> כוכב משנה </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Slide 8 היטב, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> יחידה מיקרוסקופית </td><td> אולימפוס </td><td> IX-81 מיקרוסקופ הפוך עם תא האקלים </td><td></td></tr><tr><td> מטרה </td><td> אולימפוס </td><td> 20x האובייקטיבי UPLSAPO (NA 0.75) </td><td></td></tr><tr><td> תוכנת רכישה </td><td> אולימפוס </td><td> סריקת ^ R רכישת התוכנה (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> תוכנת ניתוח </td><td> אולימפוס </td><td> סריקת ^ R ניתוח התוכנה (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

חלוקה שווה של הכרומוזומים בין תאי הבת 2 במהלך חלוקת תא היא תנאי הכרחית להבטחת יציבות גנטית 1. אי דיוקים במהלך הפרדת כרומוזום הם סימן היכר של ממאירות וקשורים עם מחלה מתקדמת 2-4. מחסום הרכבת הציר (SAC) הוא מנגנון מעקב המיטוטי שמחזיק בחזרה תאים בmetaphase עד שכל כרומוזום יחיד קימה מצורפת דו קוטבי יציבה לכישור המיטוטי 1. SAC מפעיל הפונקציה שלה על ידי הפרעה לactivating APC / C מקטע Cdc20 לחסום proteolysis של securin וcyclin B ובכך הפרדת כרומוזום ויציאה המיטוטי. התקשרות לא תקינה של כרומוזומים מונעת השתקה של SAC איתות וגורמת לעיכוב מתמשך של APC / C Cdc20 עד שהבעיה תיפתר, כדי למנוע missegregation כרומוזום, aneuploidy וגידולים ממאירים 1. רוב המחקרים שעסקוnfluence של התקשרות לא תקינה כרומוזומלית בproteolysis התלוי C APC / נצל שיבוש ציר באמצעות depolymerizing או microtubule ייצוב-תרופות להתערב בקובץ מצורף לmicrotubules כרומוזומלית. מאז התערבות בקינטיקה microtubule יכולה להשפיע התחבורה והלוקליזציה של רגולטורים קריטיים, הליכים אלה לשאת סיכון של גרימת אפקטים מלאכותיים 5. כדי ללמוד איך SAC מפריע APC / C proteolysis התלוי של cyclin B במהלך מיטוזה בשלוות נפש אוכלוסיות תאים, הקים מערכת היסטון H2-GFP מבוסס-שאפשרה ניטור סימולטני של יישור metaphase של כרומוזומים mitotic וproteolysis של cyclin 6 B . לתאר פרופילי proteolytic, יצר מולקולת כתב B cyclin chimeric עם מחצית C-מסוף SNAP 6 (איור 1). בתגובת תיוג עצמי, SNAP-המחצית היא מסוגלת ליצור קשרים כימיים עםalkylguanine-נישאים (מצע SNAP) 7,8 (איור 1). מולקולות מצע SNAP זמינות ולבצע מגוון רחב של fluorochromes השונה. מולקולות cyclin chimeric B-SNAP להיות מתויגות על תוספת של מצע SNAP קרום החדיר למדיום הגידול 7 (איור 1). בעקבות תגובת התיוג, עוצמת קרינת B-SNAP cyclin צונחת בתגובה כמו אופן ועוצמות קרינה משקפת רמות של cyclin B 6 שפלה (איור 1) הדופק מרדף. המערכת שלנו מאפשרת ניטור של המיטוטי proteolysis התלוי C APC / במספר גדול של תאים (או מספר אוכלוסיות תאים) במקביל. כך, המערכת עשויה להיות כלי רב ערך כדי לזהות סוכנים / מולקולות קטנות כי הם מסוגלים להפריע לפעילות פרוטאוליטי בmetaphase לanaphase מעבר. יתר על כן, כסינתזה של cyclin B במהלך מיטוזה באחרונה הציע כan mechanis חשובמ &#39;בטיפוח בלוק המיטוטי בעכברים ובבני אדם על ידי רמות cyclin B ביטוי יציבות 9,10 שמירה, מערכת זו אפשרה לנו לנתח proteolysis B cyclin כאלמנט אחד של שיווי משקל מאוזן 6.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations at JoVE.com

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Metaphase לanaphase מעבר מופעל באמצעות anaphase-קידום מורכב (APC / C)-התלוי ubiquitination וההרס הבא של cyclin B. הנה, הקים מערכת ש, בעקבות דופק מרדף תיוג, מאפשר ניטור proteolysis B cyclin באוכלוסיות תאים שלמות ו מאפשר זיהוי של הפרעה על ידי המחסום המיטוטי.

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Research

JoVE Journal

Biology

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

שלמות התא הקלטות של אור עורר זרמים Synaptic מעוררים פורסים את רשתית

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

דור של תרביות תאים המפוזרים Presomitic המזודרם להדמיה של דג הזברה פילוח השעון בתאים בודדים

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

ניתוח של ורטרו-טרנספוזיציה LINE-1 ברמת יחיד Nucleus

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...