Name: studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations
Uploaded: 2012-09-17T13:00:00
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Siamo grati a S. Taylor per la prestazione del pLPCX-istoni H2-GFP plasmide. Ringraziamo R. Mertelsmann per il supporto continuo. Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft.

1. Semina di U2OS a base di ciclina B-SNAP cellule Reporter (Clone 11 celle 6) su vetrini per microscopio Camera <ol><li> Tripsinizzare subconfluenti cellule giornalista SNAP che sono stati autorizzati a crescere in modo asincrono in fase di log per almeno 48 ore. </li><li> Lavorare con 8 camere e microscopio (distribuzione costante di cellule). </li></ol> Per la semina di cellule su 8 camere microscopio e ad una distribuzione costante su tutta la superficie della camera di microscop...

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	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

Vi presentiamo qui un live-cell approccio di imaging basata facilitare il monitoraggio simultaneo di proteolisi ciclina B e l&#39;allineamento dei cromosomi. Questo approccio permette lo studio del controllo mitotico negli imperturbabile popolazioni cellulari a livello di singola cellula. Curve di degradazione della ciclina B facilitare intellezioni dirette nell&#39;attività della APC / C e quindi indirettamente riflettere lo stato della SAC 6. Questo approccio, pur calcolato sul...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del prodotto </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Reporter linea cellulare </td><td> generato in-house, come descritto 6 </td><td> clonare 11 celle giornalista (U2OS basati ciclina B-cellule che esprimono SNAP) </td><td></td></tr><tr><td> Retrovirale ciclina B-SNAP vettore di espressione </td><td> generato in-house, come descritto 6 </td><td> pLNCX2-ciclina B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolred senza DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> La supplementazione con FCS, piruvato di sodio, penicillina / strepto-mycin richiesta </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Star </td><td> New England Biolabs </td><td> S9105S </td><td> Soluzione madre 400 mM in DMSO </td></tr><tr><td> Speciale Opstics Piatto, 96 pozzetti </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Slide 8 bene, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopia unità </td><td> Olimpo </td><td> IX-81 Microscopio inverso con camera climatica </td><td></td></tr><tr><td> Obiettivo </td><td> Olimpo </td><td> UPLSAPO obiettivo 20x (NA 0,75 €) </td><td></td></tr><tr><td> Acquisizione software </td><td> Olimpo </td><td> Scan ^ R Acquisizione software (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> Analisi del software </td><td> Olimpo </td><td> Scan ^ R Software di analisi (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

Distribuzione uniforme dei cromosomi tra le due cellule figlie durante la divisione cellulare è un prerequisito per garantire la stabilità genetica 1. Imprecisioni in fase di separazione dei cromosomi sono una caratteristica di malignità e associata a progressione della malattia 2-4. Il checkpoint del fuso (SAC) è un meccanismo di controllo mitotico che trattiene le cellule in metafase fino a quando ogni singolo cromosoma ha stabilito un legame stabile bipolare al fuso mitotico 1. La SAC esercita la sua funzione per interferenza con l&#39;attivazione di APC / C subunità Cdc20 di bloccare la proteolisi di securin e ciclina B e quindi la separazione dei cromosomi e uscire mitotico. Attacco improprio dei cromosomi impedisce di mettere a tacere SAC segnalamento e provoca l&#39;inibizione segue da APC / C Cdc20 fino a quando il problema è risolto per evitare missegregation cromosoma, aneuploidia e carcinomi 1. La maggior parte degli studi che hanno affrontato il influence improprio di attaccamento cromosomica su APC / C-dipendente proteolisi ha approfittato di interruzione del mandrino utilizzando depolimerizzante o microtubuli stabilizzazione farmaci di interferire con l&#39;attaccamento cromosomica ai microtubuli. Poiché interferenze con cinetiche microtubuli può influenzare il trasporto e la localizzazione dei regolatori critici, queste procedure sopportare un rischio di indurre effetti artificiali 5. Per studiare come la SAC interferisce con APC / C-dipendente della ciclina B proteolisi durante la mitosi in imperturbabile popolazioni cellulari, abbiamo stabilito un sistema di istoni H2-GFP-base che ha permesso il monitoraggio simultaneo di allineamento metafase dei cromosomi mitotici e proteolisi della ciclina B 6 . Per rappresentare profili proteolitici, abbiamo generato una molecola chimerica B ciclina reporter con una porzione C-terminale SNAP 6 (figura 1). In una reazione di auto-etichettatura, la SNAP-porzione è in grado di formare legami covalenti conalkylguanine-vettori (substrato SNAP) 7,8 (Figura 1). Molecole substrato SNAP sono facilmente disponibili e trasportare un ampio spettro di differenti fluorocromi. Chimerici ciclina B-SNAP molecole diventano etichettati dopo aggiunta della membrana permeabile substrato SNAP al mezzo di crescita 7 (Figura 1). Dopo la reazione di marcatura, l&#39;intensità ciclina B-SNAP fluorescenza gocce in un pulse-chase reazione modo simile e intensità di fluorescenza riflettere livelli di ciclina B degradazione 6 (figura 1). Il nostro sistema facilita il monitoraggio della mitotico APC / C-dipendente proteolisi in un gran numero di cellule (o più popolazioni di cellule) in parallelo. In tal modo, il sistema può essere un valido strumento per identificare agenti / piccole molecole che sono in grado di interferire con l&#39;attività proteolitica in metafase per anafase transizione. Inoltre, come sintesi di ciclina B durante la mitosi è stato recentemente proposto come un mechanis importantim nel promuovere un blocco mitotico nei topi e negli esseri umani, mantenendo stabili i livelli di espressione della ciclina B 9,10, questo sistema ci ha permesso di analizzare proteolisi B ciclina come uno degli elementi di una situazione di equilibrio 6.

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Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Metafase di anafase transizione viene attivato attraverso la promozione anafase-complesso (APC / C)-dipendente ubiquitinazione e la successiva distruzione della ciclina B. Qui, abbiamo creato un sistema che, a seguito di pulse-chase etichettatura, permette di monitorare ciclina proteolisi B in popolazioni di cellule intere e facilita la rilevazione di interferenza del checkpoint mitotico.

Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Research

JoVE Journal

Biology

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

A cellula intera Recordings of Light Evocati eccitatorio Correnti Synaptic nel Slice Retinal

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Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

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Generazione di Dispersi Presomitic mesoderma colture cellulari, per Immagini del Zebrafish segmentazione Orologio in celle singole

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

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Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

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Protocollo CUBIC Visualizza lo espressione della proteina a risoluzione singola cella di intere preparazioni della pelle Mount

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