Name: studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations
Uploaded: 2012-09-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations at JoVE.com

Vi er takknemlige for S. Taylor for å gi pLPCX-Histone H2-GFP plasmid. Vi takker R. Mertelsmann for kontinuerlig støtte. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft.

1. Seeding av U2OS-baserte cyclin B-SNAP Reporter Cells (Clone 11 Cells 6) på mikroskop Chamber Slides <ol><li> Trypsinize subconfluent SNAP reporter celler som ble tillatt å vokse asynkront i loggen fase i minst 48 timer. </li><li> Arbeide med 8 vel mikroskop kamre (konstant fordeling av celler). </li></ol> For såing av cellene bort 8 brønnen mikroskop kamre på en konstant fordeling over hele overflaten av mikroskopet kammeret, sentrifuge 10.000 celler og resuspender i 350 pl f...

<ol>
	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

Vi presenterer her en live-cell imaging tilnærming tilrettelegge samtidig overvåking av cyclin B proteolyse og kromosom justering. Denne fremgangsmåten gjør at studiet av mitotiske kontroll i uaffisert cellepopulasjoner på enkelt celle-nivå. Cyclin B degraderingsprodukter kurver rette direkte innsikt i aktiviteten av APC / C og dermed indirekte avspeile statusen av SAC 6. Denne tilnærmingen, selv om etableres basert på Skann ^ R programvare, kan lett reproduseres på ethve...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på produkt </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> Reporter cellelinje </td><td> generert på-huset som beskrevet 6 </td><td> klone 11 reporter celler (U2Os-baserte cyclin B-SNAP uttrykke celler) </td><td></td></tr><tr><td> Retroviral cyclin B-SNAP ekspresjonsvektor </td><td> generert på-huset som beskrevet 6 </td><td> pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolred-free DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> Tilskudd med FCS, natrium pyruvat, penicillin / strepto-mycin kreves </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Star </td><td> New England Biolabs </td><td> S9105S </td><td> Stamoppløsning 400 mikrometer i DMSO </td></tr><tr><td> Spesielle Opstics Plate, 96 brønner </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Slide 8 brønnen, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskopi enhet </td><td> Olympus </td><td> IX-81 inverse mikroskop med klimakammer </td><td></td></tr><tr><td> Målet </td><td> Olympus </td><td> UPLSAPO 20x objektiv (NA 0,75) </td><td></td></tr><tr><td> Oppkjøpet programvare </td><td> Olympus </td><td> Scan ^ R Acquisition programvare (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> Analyse programvare </td><td> Olympus </td><td> Scan ^ R Analyseprogram (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

Jevn fordeling av kromosomene mellom de to dattercellene ved celledeling er en forutsetning for å garantere genetisk stabilitet 1. Unøyaktigheter under kromosom separasjon er et kjennetegn på malignitet og assosiert med progressiv sykdom 2-4. Spindelen forsamlingen sjekkpunkt (SAC) er en mitotisk overvåking mekanisme som holder tilbake cellene ved metafase til hver enkelt kromosom har etablert en stabil bipolar vedlegg til mitotisk spindel en. SAC utøver sin funksjon ved forstyrrelser med aktiverende APC / C subenhet Cdc20 å blokkere proteolyse av securin og cyclin B og dermed kromosom separasjon og mitotisk exit. Feil montering av kromosomer hindrer stanse SAC signalering og forårsaker fortsatt hemming av APC / C Cdc20 til problemet er løst, for å unngå kromosom missegregation, Aneuploidy og ondartede vekster en. De fleste studier som er adressert til jegnfluence av feil kromosomal feste på APC / C-avhengige proteolyse tok fordel av spindel avbrudd med depolymerizing eller microtubule-stabiliserende medikamenter for å forstyrre kromosomal vedlegg til mikrotubuli. Siden forstyrrelser microtubule kinetikk kan påvirke transport og lokalisering av kritiske regulatorer, disse prosedyrene bære en risiko for å indusere kunstige effekter 5. Å studere hvordan SAC forstyrrer APC / C-avhengige proteolyse av cyclin B under mitose i uaffisert cellepopulasjoner, etablerte vi en histone H2-GFP-basert system som tillot samtidig overvåking av metafase justering av mitotiske kromosomer og proteolyse av cyclin B 6 . Å skildre proteolytiske profiler genererte vi et kimært cyclin B reporter molekyl med en C-terminal SNAP moiety 6 (figur 1). I en selv-merking omsetningen er den SNAP-moiety stand til å danne kovalente bindinger medalkylguanine-bærere (SNAP substrat) 7,8 (figur 1). SNAP substratmolekyler er lett tilgjengelig og har et bredt spekter av forskjellige fluorokromer. Kimære cyclin B-SNAP molekyler blir merket ved tilsetning av den membran-gjennomtrengelige SNAP substrat til vekstmediet 7 (figur 1). Etter merking reaksjonen synker cyclin B-SNAP fluorescensintensitet i et puls-chase reaksjon-aktig måte og fluorescensintensiteter reflekterer nivåene av cyclin B degradering 6 (figur 1). Vårt system forenkler overvåking av mitotiske APC / C-avhengig proteolyse i et stort antall celler (eller flere cellepopulasjoner) i parallell. Dermed kan systemet være et verdifullt verktøy for å identifisere agenter / små molekyler som er i stand til å forstyrre proteolytisk aktivitet på metafase å anaphase overgang. Videre har som syntese av cyclin B under mitose nylig blitt foreslått som en viktig mechanism for å fremme en mitotisk blokk i mus og mennesker ved å holde cyclin B uttrykk nivåer stabil 9,10, aktivert dette systemet å analysere cyclin B proteolyse som en del av et balansert likevekt 6.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations at JoVE.com

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Metafase å anaphase overgang utløses gjennom anaphase-fremme kompleks (APC / C)-avhengig ubiquitinering og påfølgende ødeleggelse av cyclin B. Her har vi etablert et system som etter puls-chase merking, tillater overvåking cyclin B proteolyse i hele cellepopulasjoner og forenkler påvisning av forstyrrelse fra mitotiske sjekkpunkt.

Studerer proteolyse av Cyclin B på Single Cell nivå i hele cellepopulasjoner

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Research

JoVE Journal

Biology

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Kvantitativ måling av Invadopodia-mediert Extracellular Matrix proteolyse i enkeltrom og Flercellede Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Generering av dispergert Presomitic mesoderm cellekulturer for Imaging av sebrafisk Segmentering Klokke i enkeltceller

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse av global RNA syntese på celle-nivå etter Hypoksi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

En kanal Cell-festet Patch-clamp opptak

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Analyse av LINE-en Retrotransposition på enkelt Nucleus nivå

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

CUBIC Protocol Visualiserer Protein Expression på enkelt celle oppløsning i Hele Mount hud preparater

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...