Name: studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations
Uploaded: 2012-09-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations at JoVE.com

Vi är tacksamma för S. Taylor för att ge pLPCX-histon H2-GFP plasmid. Vi tackar R. Mertelsmann för fortsatt stöd. Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft.

1. Sådd av U2OS-baserade cyklin B-SNAP Reporter celler (klon 11 celler 6) på objektglas Chamber <ol><li> Trypsinisera subkonfluenta celler SNAP reporter som tilläts växa asynkront i log-fas minst 48 timmar. </li><li> Att arbeta med 8 väl mikroskop kammare (konstant fördelning av celler). </li></ol> För ympning av celler på 8 väl mikroskop kammare vid en konstant fördelning över hela ytan av mikroskop kammaren, centrifug 10.000 celler och återsuspendera i 350 pl av fenolr?...

<ol>
	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

Vi presenterar här en live-cell imaging strategi underlättar samtidig övervakning av cyklin B proteolys och kromosom inriktning. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att studera mitotiska kontroll i ostörda cellpopulationer på den enda cellnivå. Cyklin B nedbrytning kurvor underlätta direkta insikter i aktiviteten av APC / C och därmed indirekt återspeglar status SAC 6. Detta tillvägagångssätt, även om fastställts baserat på Scan ^ R programvara kan enkelt r...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på produkt </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> Reporter cellinje </td><td> genereras internt beskrivs 6 </td><td> klon 11 reporter celler (U2Os-baserade cyklin B-SNAP-uttryckande celler) </td><td></td></tr><tr><td> Retroviral cyklin B-SNAP expressionsvektor </td><td> genereras internt beskrivs 6 </td><td> pLNCX2-cyklin B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolred DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> Komplettering med FCS, natriumpyruvat, penicillin / strepto-mycin krävs </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Star </td><td> New England Biolabs </td><td> S9105S </td><td> Stamlösning 400 pM i DMSO </td></tr><tr><td> Särskilda Opstics Plate, 96 och </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Slide 8 bra, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80.826 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskopi enhet </td><td> Olympus </td><td> IX-81 omvänt mikroskop med klimatkammare </td><td></td></tr><tr><td> Mål </td><td> Olympus </td><td> UPLSAPO 20x objektiv (NA 0,75) </td><td></td></tr><tr><td> Förvärv programvara </td><td> Olympus </td><td> Scan ^ R Förvärv programvara (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> Analysprogram </td><td> Olympus </td><td> Scan ^ R Analys programvara (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

Jämn fördelning av kromosomer mellan de två dotterceller under celldelning är en förutsättning för att garantera genetisk stabilitet 1. Felaktigheter under kromosom separation är ett kännetecken för malignitet och i samband med progressiv sjukdom 2-4. Spindeln montering kontrollpunkten (SAC) är ett mitotiska övervakningsmekanism som håller tillbaka celler vid metafas tills varenda kromosom har etablerat en stabil bipolär anslutning till den mitotiska spindeln 1. SAC utövar sin funktion genom interferens med aktiverande APC / C-subenhet CDC20 att blockera proteolys av Sekurin och cyklin B och därmed kromosom separation och mitotisk avsluta. Felaktig fastsättning av kromosomer förhindrar tysta SAC signalering och orsakar fortsatt hämning av APC / C CDC20 tills problemet är löst för att undvika kromosom missegregation, aneuploidi och elakartade svulster 1. De flesta studier som riktar den influence på felaktig kromosomal fastsättning på APC / C-beroende proteolysen utnyttjade spindel störningar med depolymerisering eller mikrotubuli-stabiliserande läkemedel för att störa kromosomal anknytning till mikrotubuli. Eftersom störningar mikrotubuli kinetik kan påverka transport och lokalisering av kritiska tillsynsmyndigheter, dessa förfaranden bär en risk för att inducera konstgjorda effekter 5. Att studera hur SAC stör APC / C-beroende proteolysen av cyklin B under mitos i oberörd cellpopulationer har vi etablerat en histon H2-GFP-baserad system som tillät samtidig övervakning av metafas anpassning av mitotiska kromosomer och proteolys av cyklin B 6 . Att skildra proteolytiska profiler, genererade vi en chimär cyklin molekyl B reporter med en C-terminal SNAP delen 6 (figur 1). I en egen märkning reaktionen är SNAP-gruppen kan bilda kovalenta bindningar medalkylguanin-bärare (SNAP-substrat) 7,8 (Figur 1). SNAP substratmolekyler är lätt tillgängliga och bär ett brett spektrum av olika fluorokromer. Chimära cyklin B-SNAP molekyler blir märkt vid tillsats av membran-permeabla SNAP substrat till odlingsmediet 7 (figur 1). Efter märkningsreaktionen faller cyklin B-SNAP fluorescensintensitet i en puls-chase reaktion-liknande sätt och fluorescensintensiteter återspeglar nivåerna av cyklin B nedbrytning 6 (figur 1). Vårt system underlättar övervakningen av mitotisk APC / C-beroende proteolys i ett stort antal celler (eller flera cellpopulationer) parallellt. Därigenom kan systemet vara ett värdefullt verktyg för att identifiera ämnen / små molekyler som kan störa proteolytisk aktivitet vid metafas att anafas övergång. Dessutom har som syntes av cyklin B under mitos nyligen föreslagits som en viktig mechanism främja en mitotiskt block i möss och människor genom att hålla cyklin B uttrycksnivåer stabila 9,10, gjorde detta system oss att analysera cyklin B proteolys som en del av en balanserad jämvikt 6.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations at JoVE.com

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Metafas att anafas övergång utlöses genom anafas-befrämjande komplex (APC / C)-beroende ubikitinering och påföljande destruktion av cyklin B. Här har vi etablerat ett system som, efter puls-chase märkning, medger övervakning cyklin B proteolys i hela cellpopulationer och underlättar detekteringen av störningar av den mitotiska kontrollpunkten.

Studera Proteolys av cyklin B på den inre cellnivå i hela cellpopulationer

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Research

JoVE Journal

Biology

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

Helcells-Inspelningar av Ljus Evoked excitatoriska Synaptic strömmar i näthinnan Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Erhålla hög kvalitet RNA från Single cellpopulationer i Human obduktion hjärnvävnad

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Metod för mätning av Viral Fusion Kinetics på enskild partikel nivå

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Encelliga Sug Inspelningar från fotoreceptorer Mus Cone

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Kvantitativ mätning av Invadopodia-medierad extracellulär matrix proteolys i enkel-och flercelliga kontexter

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Generering av Spritt Presomitic mesoderm cellkulturer för avbildning av Zebrafish Segmente Klocka i enstaka celler

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analys av global RNA syntes vid den inre cellnivå efter Hypoxi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

En-kanals Cell-ansluten Patch-clamp inspelning

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Analys av LINE-1 retrotransposition på den inre Nucleus nivå

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

CUBIC protokoll Visualiserar proteinuttryck på Single Cell Beslut hela montera hudpreparat

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...